肺癌是当前对人类健康与生命危害最大的恶性肿瘤之一,发病率呈不断上升趋势,并已成为目前人类因癌症死亡的主要原因,5年生存率不到15%。近年来,由于分子生物学和分子遗传学的迅速发展,对肺癌发病分子机制的认识也不断深入。肺癌的发生和其他肿瘤一样,其实质是基因异常的结果。许多致癌因素均可通过激活原癌基因和/或使抑癌基因失活而使细胞发生转化和癌变。肿瘤抑制因子候选基因3(tumor suppressor candidate3, TUSC3)是1996年MacGrogan等对人类8号染色体短臂进行分析时首次确认,并发现该基因表达于多种上皮细胞和组织,例如前列腺、结肠、肺组织和肝脏组织中。因TUSC3基因启动子区CpG岛甲基化增高,并与细胞的恶性转化密切相关,故被认为是肿瘤抑制基因。TUSC3基因与酵母Ost3p蛋白的编码基因同源,认为TUSC3基因编码蛋白质是OST(oligosaccharyltransferase,酵母寡糖基转移酶)复合物的亚基,推测TUSC3表达情况的变化对蛋白糖基化发生影响。而蛋白的糖基化异常导致大量蛋白异常集聚于内质网,无法正确转运出去,进而诱导产生内质网应激,影响细胞增殖凋亡平衡,甚至导致癌变,因此TUSC3基因与内质网应激所诱导的凋亡关系密切。本研究首先应用组织芯片的方法,初步观察TUSC3表达在肺癌组织及正常肺组织的差异,发现小细胞肺癌中TUSC3的表达与正常组织有明显的差异,因此以小细胞肺癌细胞系H446为研究切入点继续深入研究。体外实验从过表达和沉默TUSC3基因表达两方面来阐述TUSC3对小细胞肺癌细胞系H446生物学行为的影响。在过表达的干预实验部分,我们通过脂质体转染、RT-PCR, western blot、CCK-8细胞增殖实验、克隆形成等实验技术,发现过表达TUSC3可以明显抑制小细胞肺癌H446细胞的生长；而在siRNA沉默TUSC3基因的干预实验部分,我们首先利用衣霉素来构建内质网应激模型,并通过检测内质网应激信号通路PERK-eIF2α-CHOP中关键蛋白的表达变化,初步阐明TUSC3基因对于小细胞肺癌能够耐受内质网应激所致凋亡而继续生存的机制。体内实验是利用裸鼠成瘤的方法研究TUSC3基因在小细胞肺癌裸鼠荷瘤模型上的抑瘤作用,对小细胞肺癌的基因治疗进行探索。同时,我们还收集临床患者血清标本进行血清TUSC3水平及配体相关的凋亡通路中死亡受体可溶形式sDR5的表达检测,以期能发现协助提高肺癌的诊治率的血清肿瘤标志物,为临床应用提供依据。本课题分为三大部分。第一部分：TUSC3的生物信息学分析。第二部分：TUSC3在小细胞肺癌中的作用及对内质网应激所致的凋亡影响,包括四章：第一章：肺癌组织芯片中TUSC3表达及与临床病理指标的相关性研究；第二章：TUSC3载体构建及过表达对小细胞肺癌细胞系H446生物学行为的影响；第三章：TUSC3基因沉默对小细胞肺癌细胞系H446生物学行为的影响及与内质网应激诱导凋亡的关系；第四章：TUSC3对人小细胞肺癌细胞系H446荷瘤裸鼠种植瘤的生长抑制作用。第三部分：血清肿瘤标志物在肺癌中的研究,包括两章：第一章：血清TUSC3及sDR5检测在小细胞肺癌诊治中的意义；第二章：血清sDR5检测在Ⅲ期不可手术非小细胞肺癌诊治中的意义。第一部分TUSC3的生物信息学分析目的：利用生物信息学分析软件,在线对TUSC3基因的碱基序列及编码蛋白的氨基酸序列进行分析,并对TUSC3的结构及理化性质进行了预测。方法：从NCBI查获人类TUSC3的全长基因序列、mRNA序列及氨基酸片段序列,利用ORF Finder和B1AST等在线工具,分析其核苷酸基本特征及同源性；利用在线工具Protscale、ProtParam、TMpred、SignalP3.0等完成疏水性分析、可溶性分析、跨膜区分析、蛋白质信号肽预测；利用SOPMA在线工具完成蛋白质二级结构的预测；PSORTⅡ预测亚细胞定位；利用NetOGlyc4.0Server程序做蛋白质糖基化分析；利用Gene3D、MMDB软件等预测TUSC3蛋白的三维结构。结果：人TUSC3基因mRNA序列及蛋白序列都可以查到。蛋白偏酸性,原子组成以C、H、O、N, S为主,人、鼠等有较高同源性,说明该基因编码蛋白结构保守；TUSC3蛋白是疏水性蛋白,有5个可能的跨膜结构域,主要定位于内质网和线粒体,含有3个糖基化位点。TUSC3蛋白可能是一种分泌性蛋白,且该蛋白存在三级结构,是一个功能蛋白。第二部分TUSC3在小细胞肺癌中的作用及对内质网应激所致凋亡的影响第一章肺癌组织芯片中TUSC3表达及与临床病理指标的相关性研究目的：检测肺癌组织芯片中TUSC3的表达,分析其表达水平与肺癌组织临床病理指标之间的关系。方法：应用免疫组织化学方法检测组织芯片正常肺组织和肺癌组织(包括小细胞肺癌、腺癌、鳞癌)中TUSC3的表达情况,采用IRS评分方法对TUSC3做定量判断,并分析它们与TNM临床分期、T分期、淋巴结转移分期、病理分级等指标的关系及相关性,应用SPSS13.0统计软件进行数据处理。结果：(1) TUSC3在肺癌组织中的总体表达阳性率与正常组织比较无统计学差异(P=0.123)；亚组分析中发现小细胞肺癌中TUSC3的阳性表达率明显低于正常肺组织(P=0.001),腺癌、鳞癌分别与正常组织比较均未见明显统计学差异(P=0.114；P=0.614)。(2)TNM分期较晚(Ⅲ+Ⅳ期)的肺癌组织中TUSC3表达阳性率水平明显低于TNM分期较早(Ⅰ+Ⅱ期)者(P=0.027)；淋巴结转移阳性患者的肺癌组织中TUSC3表达阳性率明显低于淋巴结转移阴性患者的肺癌组织(P=0.011)；病理高分级(3+4级)患者肺癌组织TUSC3表达阳性率明显低于低分级(1+2级)患者(P=0.000)。(3)小细胞肺癌中,随着TNM临床分期和淋巴结转移分期的增加,TUSC3的表达逐渐降低(rs=0.4638；rs=0.3835),未发现TUSC3与T分期的相关关系(P=0.857)。(4)腺癌中,TUSC3随着TNM临床分期、淋巴结转移分期、病理分级的增加,TUSC3的表达逐渐降低(rs=0.5245; rs=0.167; rs=0.611),但未发现TUSC3与T分期的相关关系(P=0.903)。(5)鳞癌中,随着淋巴结转移分期的增加,TUSC3的表达逐渐降低(rs=0.119)；随着病理分级的逐渐增加,TUSC3逐渐降低(rs=0.329),未发现TUSC3与TNM分期及与T分期的相关关系(P=0.173；P=0.678)。结论：1. TUSC3在小细胞肺癌中的表达明显低于正常组织,TUSC3表达水平与TNM临床分期和淋巴结转移分期负相关,推测TUSC3可能参与小细胞肺癌的发生发展。在非小细胞肺癌中(包括腺癌、鳞癌)未发现TUSC3表达与正常组织的明显差异。2. TUSC3与肺癌的淋巴结转移密切相关,可以作为肺癌患者淋巴结转移情况的一个预测指标。3.肺癌中TUSC3的表达水平与组织病理分级负相关,病理分级越高,恶性程度越高,TUSC3表达越低。第二章TUSC3载体构建及过表达对小细胞肺癌细胞系H446生物学行为的影响目的：探讨TUSC3过表达对人小细胞肺癌细胞系H446生物学行为的影响。方法：首先构建包含TUSC3基因真核表达载体。采用脂质体转染技术建立体外TUSC3过表达细胞模型,EGFP荧光检测转染效率。RT-PCR、Western blot技术检测TUSC3mRNA和蛋白水平变化；CCK-8法检测TUSC3过表达前后H446细胞增殖能力的变化；克隆形成实验检测TUSC3过表达前后H446细胞克隆形成能力的变化；划痕愈合实验观察TUSC3过表达前后H446细胞迁移能力的变化。结果：(1)成功构建TUSC3真核表达载体,并经酶切和基因测序验证。(2)CCK-8实验结果显示：与转染空载体的H446细胞对比,转染TUSC3的H446细胞存活率明显降低(P<0.05)；克隆形成实验显示：与转染空载体的H446细胞对比,过表达TUSC3的H446细胞克隆形成能力明显下降(P<0.05)；划痕愈合实验显示：与转染空载体的H446细胞对比,过表达TUSC3的H446细胞迁移能力明显下降(P<0.05)。结论：过表达TUSC3可以明显抑制小细胞肺癌细胞系H446的增殖和迁移能力。第三章TUSC3基因沉默对小细胞肺癌细胞系H446细胞生物学行为的影响及与内质网应激诱导凋亡的关系目的：探讨siRNA转染后TUSC3基因沉默对小细胞肺癌细胞系H446生物学行为的影响,并进一步探讨内质网应激情况下TUSC3基因沉默对应激通路PEAK-eIF2α-CHOP的影响。方法：首先采用浓度梯度法确定衣霉素的最适浓度,用于构建内质网应激模型。本实验确定四个实验组,分别为转染阴性对照siRNA组(N组),siRNA基因沉默组(S组),衣霉素诱导的内质网应激模型组(衣组),siRNA沉默干预的内质网应激模型组(S+衣组)。针对TUSC3基因设计两对siRNA序列,采用脂质体转染技术将siRNA转染H446细胞,运用RT-PCR、 Western blot检钡TUSC3mRNA和蛋白质的表达变化,评价基因干扰效果；CCK-8法检测四组中H446细胞的增殖能力的变化并绘制生长曲线；AnnexinV FITC-PI双染后用流式细胞仪检测四组细胞凋亡率；通过Western blot检测四组中PEAK-eIF2α-CHOP通路关键蛋白在各组中的表达情况。结果：(1) TUSC3基因siRNA(4557,50nM)转染人小细胞肺癌细胞系H446后可有效抑制TUSC3基因的表达及TUSC3蛋白的表达,抑制率达75-85%。(2)CCK-8实验显示：与转染negative-siRNA的细胞株对比,转染siRNA-TUSC3基因沉默后H446细胞的存活率稍有增加,但无统计学差异(P>0.05);25ng/mL衣霉素诱导内质网应激后,siRNA-TUSC3沉默后的H446细胞存活率明显高于转染negative-siRNA-TUSC3的H446细胞存活率(P<0.05)。(3) Annexin V FITC-PI双染法检测显示,与转染negative-siRNA的H446细胞对比,转染siRNA-TUSC3基因沉默后H446细胞凋亡率稍有降低,但无统计学差异(P>0.05)。25ng/mL衣霉素诱导内质网应激后,siRNA-TUSC3沉默后的H446细胞凋亡率明显低于转染negative-siRNA-TUSC3的H446细胞凋亡率(P<0.05)。(4) Western blot检测四组细胞PEAK-eIF2α-CHOP通路关键蛋白的表达,结果显示：PEAK、eIF2a在四组细胞中均存在且表达无明显统计学差异(P>0.05), p-PERK, p-eIF2α、CHOP蛋白只在25ng/mL衣霉素诱导内质网应激后表达；25ng/mL衣霉素诱导内质网应激后,转染SiRNA-TUSC3的H446细胞中p-PEAK、p-eIF2α、CHOP的表达水平较转染negative-siRNA-TUSC3组明显降低(P<0.05)。结论：内质网应激情况下,TUSC3表达下调可以减少内质网应激通路蛋白p-PERK、p-eIF2α、CHOP的表达,进而增加H446小细胞肺癌对内质网应激所致凋亡的抗拒性,促进小细胞肺癌细胞系H446的增殖,减少凋亡。第四章TUSC3对人小细胞肺癌细胞系H446荷瘤裸鼠种植瘤的生长抑制作用目的：研究TUSC3对小细胞肺癌H446细胞荷瘤裸鼠种植瘤生长的抑制作用。方法：采用皮下接种人小细胞肺癌H446细胞悬液的方法构建裸鼠种植瘤模型,观察pcDNA3-TUSC3质粒在体内对H446细胞的生长抑制作用。结果：与pcDNA3空质粒注射对照组相比,pcDNA3-TUSC3注射组裸鼠瘤体积及瘤重量均明显降低(P<0.05),抑瘤率达48%。结论：TUSC3对人小细胞肺癌细胞系H446裸鼠种植瘤的生长有明显的抑制作用。第三部分血清肿瘤标志物在肺癌中的研究第一章血清TUSC3及sDR5检测在小细胞肺癌诊疗中的意义目的：观察小细胞肺癌患者血清TUSC3和可溶性死亡受体DR5(sDR5)水平与临床指标及治疗疗效的关系。方法：用酶联免疫吸附法检测82例小细胞肺癌患者和50例健康成人血清TUSC3和sDR5水平,并与患者PS评分、吸烟状况、临床分期、肿瘤大小、淋巴结转移及放化疗后近期疗效等指标进行分析,采用SPSS13.0软件进行统计分析。结果：(1)小细胞肺癌患者血清TUSC3水平为5.89±2.01pg/ml,明显低于健康人血清TUSC3水平(8.87±2.72pg/ml),差异有统计学意义(P<0.05)。(2)小细胞肺癌患者血清sDR5的水平为18.95±4.80pg/ml,明显高于健康人血清sDR5水平(10.89±6.72pg/m1),差异有统计学意义(P<0.05)。(3)血清TUSC3的表达在PS(0-1)患者组明显高于PS(2-3)患者组,两者之间差异有统计学意义(P<0.05)；广泛期小细胞肺癌患者TUSC3表达水平明显低于局限期患者,两者之间存在显著的统计学差异(P<0.05)；未发现TUSC3表达在吸烟与否分组之间、不同肿瘤大小分组之间、有无淋巴结转移分组之间的表达存在统计学差异(P>0.05)。(4)血清sDR5的表达在吸烟组与非吸烟组之间存在差异,吸烟患者sDR5明显高于非吸烟患者(P<0.05)；广泛期小细胞肺癌患者sDR5表达水平明显高于局限期患者,两者之间存在显著的统计学差异(P<0.05)sDR5的表达在大肿块组(>3cm)患者明显高于非大肿块(≤3cm)患者(P<0.05)；淋巴结转移阳性患者血清sDR5明显高于淋巴结转移阴性患者(P<0.05)；未发现sDR5表达在不同PS评分患者分组之间的差异(P>0.05)。(5)治疗前后血清sDR5水平分别为5.89±2.01pg/ml vs.6.05±1.74pg/ml,18.95±4.80pg/ml vs.13.54±3.75pg/ml。治疗后sDR5较治疗前明显降低(P=0.000),而TUSC3变化无统计学差异(P=0.061)。(6) SCLC患者经治疗后,总体有效率为80.5%。对于治疗有效组(CR+PR)患者来说,治疗后sDR5表达水平明显低于治疗无效组(SD+PD),差异有统计学意义(P<0.05)。而将患者分为治疗有效组和治疗无效组,对TUSC3表达水平分析发现,不论是治疗前水平,还是治疗后水平,两组间比较时均未发现TUSC3表达变化有明显的统计学差异(P>0.05)。结论：1.血清TUSC3在小细胞肺癌中低于正常人群,未发现对放化疗后近期疗效的预测效果。2.血清sDR5在小细胞肺癌中高于正常人群；血清sDR5对小细胞肺癌患者放化疗治疗疗效有预测作用,治疗后sDR5较低者近期疗效好。第二章血清sDR5检测在Ⅲ期不可手术非小细胞肺癌诊治中的意义目的：观察Ⅲ期不可手术非小细胞肺癌患者血清sDR5水平与临床指标、治疗疗效及预后的关系。方法：用酶联免疫吸附法检测122例非小细胞肺癌患者和50例健康成人血清sDR5水平,并与患者TNM临床分期,淋巴结转移状况、放化疗疗效、无进展生存期(PFS)等指标进行分析,采用SPSS13.0软件进行统计分析。结果：(1)非小细胞肺癌患者血清TUSC3水平为13.72±3.61pg/ml,明显高于健康人血清TUSC3水平(10.8±6.72pg/m1),差异有统计学意义(P<0.05),但在腺癌和鳞癌组之间无明显差异(13.67±3.89pg/ml vs.13.77±3.32pg/ml；P>0.05)。(2)非小细胞肺癌ⅢB期患者血清sDR5表达明显高于ⅢA期(P=0.009)；大肿块(>3cm)患者血清sDR5表达明显高于非大肿块(≤3cm)患者(P=0.026)；T4患者血清sDR5明显高于T1期患者(P=0.000)；不同淋巴结(N)分期各组比较时sDR5表达未发现明显差异(P>0.05)。(3)治疗前后血清sDR5水平分别为13.7±3.61pg/ml和13.39±3.39pg/ml,两者差异无统计学意义(P=0.462)；将患者按近期疗效分为治疗有反应组(CR+PR)及治疗无反应组(SD+PD),然后将两组治疗前的sDR5进行比较发现：治疗前的sDR5水平在治疗有反应组和无反应组之间有明显差异(P<0.0001),未发现治疗后sDR5水平在有反应组和无反应组之间的差异(P>0.05)。(4)生存分析显示治疗前sDR5低表达组(≤14pg/ml)患者的PFS明显长于高表达组(>14pg/ml)患者(P=0.003),治疗后sDR5表达水平与PFS无关(P>0.05)。结论：1.血清sDR5在Ⅲ期不可手术非小细胞肺癌中表达高于正常人群。2.血清sDR5可以作为Ⅲ期不可手术非小细胞肺癌治疗疗效及预后的预测指标。治疗前sDR5低表达者预示着良好的近期疗效；对于sDR5≤14pg/ml者有较长的无进展生存期。