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脑出血(Intracerebral hemorrhage,ICH)是一种高致病率和高死亡率的卒中亚型,主要发生在有丰富神经纤维的基底节区,能造成血肿周围严重的白质损伤(White matter injury,WMI),从而导致严重的运动功能失调和病人的预后不良。对于血肿周围白质的保存对运动功能康复至关重要,但目前为止却没有有效的治疗手段。锂盐已被用于治疗精神系统疾病双向情感障碍(Bipolar disease;BD)数十年。近年来,尽管锂盐对神经退行性疾病和颅脑创伤的保护作用已经被证实,但锂盐能否被用于减轻脑出血后的白质损伤仍然有待研究。本研究发现,氯化锂(Lithium chloride,LiCl)干预能明显改善脑出血小鼠的运动行为障碍和电生理功能,能减轻脑出血诱导的包括髓鞘和轴突变性降解在内的白质病理损伤。此外,LiCl治疗能减少小鼠成熟少突胶质细胞(Oligodendrocytes,OLGs)的死亡,这种作用可能和糖原合成激酶3β(Glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)介导的脑源性神经生长因子(Brain derived neurotrophic factor,BDNF)的上调有关。这种成熟少突胶质细胞的死亡减少和髓鞘和轴突的变性降解的减轻密切相关。综上所述,本研究提示锂盐对脑出血白质的保护作用可能和BDNF的表达增加有关,而LiCl治疗可能是减轻脑出血后白质损伤潜在治疗方法。一、脑出血后小鼠的白质病理损伤和运动功能障碍目的探究脑出血后小鼠的运动功能障碍和白质病理变化。方法采用自体血注射方法在成年雄性C57/BL6小鼠(8-10周龄,23-30 g)进行立体定位脑出血造模。小鼠被随机的分成两组:假手术组(sham组)和脑出血组(ICH组)。采用BMS评分、爬杆平衡测试和前肢肌肉力量评分(n=6)、电生理运动诱发电位记录(n=6)、免疫荧光(n=5)、免疫蛋白印迹(n=5)和透射电镜(n=6)等方法,统计分析行为学分值、运动诱发电位潜伏期、荧光密度、灰度分析和电镜髓鞘损伤评分等指标。结果1.从脑出血造模后第1天到第14天都可见ICH组BMS评分,爬杆平衡测试评分和小鼠前肢肌力分值明显低于Sham组。2.运动诱发电位结果提示,与sham组小鼠相比,ICH组从脑出血造模后第1天到第14天,小鼠左侧肢体(对应右脑出血)潜伏期明显延长。3.小鼠脑冠状切片免疫荧光染色结果表明,ICH组的脑出血血肿周围轴突标记分子NF200的荧光密度明显低于sham组,轴突降解相关分子SMI-32荧光密度较sham组显著增强;而血肿周围髓鞘标记分子MBP荧光密度低于sham组,髓鞘降解相关分子DMBP荧光密度较sham组明显增加。4.提取鼠脑血肿周围的白质组织蛋白进行western blotting分析发现,ICH组血肿周围白质中MBP、NF200蛋白含量和sham组相比明显降低,而SMI32的蛋白含量明显增加。5.透射电镜结果显示,血肿周围白质严重破坏,发生髓鞘剥脱甚至连续性散失,同时ICH组的髓鞘损伤评分显示脑出血后第3天、第7天与sham组相比相对完整的髓鞘比率明显降低,G值显示髓鞘厚度明显变薄。结论综上所述,小鼠脑出血后血肿周围白质明显降解损伤,并且存在神经传导异常和明显的运动功能障碍。二、锂盐治疗对脑出血小鼠白质损伤的作用和机制研究目的验证氯化锂对小鼠的毒性反应及相对安全剂量,探究氯化锂干预后能否改善小鼠脑出血周围白质损伤及其具体机制。方法1.野生型C57/BL6成年雄性小鼠(8-10周龄,23-30 g)按不同剂量的氯化锂进行腹腔注射并分成以下4组:42.4 mg/kg组、84.8 mg/kg组、169.6 mg/kg组和339.2 mg/kg组,采用BMS评分、爬杆平衡测试和体重称量等手段,分析单次的药物治疗后短期不同时间点的运动功能改变和长期连续药物治疗7天的运动功能动态变化和体重变化情况。2.采用自体血注射方法对小鼠进行立体定位脑出血造模。将小鼠随机分成以下4组:Sham组、ICH组、ICH+42.4 mg/kg组和ICH+84.8 mg/kg组。采用BMS评分、爬杆平衡测试和前肢肌肉力量的运动行为学评分(n=6)、电生理运动诱发电位(MEPs)记录(n=6)、免疫荧光(n=5)、免疫蛋白印迹(western blotting)(n=5)和透射电镜(TEM)(n=6)等方法,统计分析行为学分值、运动诱发电位潜伏期、荧光密度、灰度分析和电镜髓鞘损伤评分,G值等指标。3.采用免疫荧光、免疫蛋白印迹、TUNEL凋亡检测和PI细胞死亡检测等方法,检测白质相关分子BDNF、GSK-3β的表达情况和细胞定位,检测锂盐对成熟少突胶质细胞死亡的影响。结果1.高剂量的Li Cl(169.6 mg/kg和339.2 mg/kg)治疗后的小鼠表现出运动评分不同程度的减少和体重减轻,而42.4 mg/kg、84.8 mg/kg的Li Cl治疗没有表现出明显的运动行为学改变。2.采用42.4 mg/kg Li Cl治疗脑出血小鼠使运动功能评分和MEPs潜伏期不同程度的恢复,然而84.8 mg/kg Li Cl不能明显改善小鼠运动功能障碍和MEPs潜伏期。3.脑出血后第3天小鼠用42.4 mg/kg Li Cl进行治疗后NF200、MBP的荧光密度显著增加,SMI 32、DMBP的荧光密度有所降低;NF200、MBP蛋白水平明显增加,SMI-32蛋白水平降低。4.透射电镜结果显示42.4 mg/kg Li Cl治疗可降低脑出血后第3天的脱髓鞘程度,表现为G值下降、髓鞘损伤评分的改善。5.Li Cl干预能减少成熟少突胶质细胞的死亡并且抑制GSK-3β,增加BDNF的表达。结论以上研究结果提示:1)野生型小鼠Li Cl治疗的相对安全剂量为42.4 mg/kg和84.8mg/kg;2)42.4 mg/kg Li Cl治疗能够明显改善脑出血小鼠的白质损伤;3)锂盐对白质损伤的改善作用可能和GSK-3β抑制介导的BDNF上调和减少成熟少突胶质细胞的死亡有关。