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背景与目的:细胞自噬是一种将细胞内容物运送到溶酶体进行降解的程序性细胞死亡方式,诱导或抑制自噬都会导致癌细胞的死亡。目前研究者已经证实在肿瘤的发生发展过程中自噬活性具有两面性,既有促进肿瘤发生发展的作用,也有抑制肿瘤生长诱导其细胞死亡的作用,自噬与肿瘤的关系十分复杂,也存在着不少的分歧。本课题通过比较白血病多药耐药K562/ADM细胞及其亲本K562细胞对植物抗毒素白藜芦醇的敏感性,以及白藜芦醇诱导的自噬活化与细胞凋亡作用,探讨白藜芦醇诱导的白血病细胞自噬活性与细胞凋亡之间的关系,探讨白藜芦醇诱导耐药性白血病细胞凋亡的自噬机制,为临床克服白血病细胞耐药性、提高耐药性白血病细胞的药物敏感性提供理论基础。方法:MTT比色检测药物对细胞的增殖抑制,透射电镜和MDC荧光染色观察细胞自噬形态学的改变,Western-blotting检测自噬相关蛋白LC3、Beclin-1及P62的表达。FCM检测细胞周期变化,流式细胞术AnnexinV/PI双染检测细胞凋亡率,Western-blotting和流式细胞术检测凋亡相关蛋白caspase-3、Bcl-2、Bax和细胞色素c(Cyt c)、组织蛋白酶D(Cath D)以及P-糖蛋白(P-gp)的表达,FCM检测活性氧的变化水平。结果:1.MTT实验表明,不同浓度的白藜芦醇对白血病耐药细胞K562/ADM及敏感细胞K562均具有增殖抑制作用。K562细胞48h的IC50值为46.67±0.38μmol/L,而K562/ADM细胞的IC50值为57.71±0.67μmol/L,可以看出K562/ADM细胞对白藜芦醇具有一定的耐受性。2.透射电镜和MDC荧光染色结果显示,白藜芦醇作用两种细胞后胞内自噬泡数目均明显增多,核周的点状荧光强度也增高,且K562/ADM细胞较其亲本K562细胞自噬泡增多明显。WB检测结果显示不同浓度的白藜芦醇作用细胞后,K562/ADM细胞中与对照组相比自噬标志蛋白LC3、Beclin-1的表达明显上调,而P62蛋白在72h后表达不足对照组的三分之一;而敏感细胞K562内LC3和Beclin1的表达量也有轻度上调,但低于耐药细胞株,P62的表达变化不是很明显。3.白藜芦醇诱导K562/ADM细胞和K562细胞发生凋亡。流式细胞仪检测两种细胞株的总凋亡率均明显升高,并且呈浓度依赖性;细胞周期发生明显变化,G0/G1期细胞逐渐增多,而S期细胞减少(P<0.05),且对K562细胞的周期阻滞作用更明显;同时对凋亡相关分子的检测也显示药物作用两种细胞后可促进caspase-3的活化、降低Bcl-2/Bax比值,并伴有Cyt c释放增加及ROS产生增多。这些结果与WB结果相一致。令人关注的是我们的实验证实Cathepsin D经药物作用后,在耐药细胞K562/ADM中的表达显著上调,72小时后的表达量已接近对照组的3倍;而敏感细胞K562中仅轻度上调。最后WB检测结果显示白藜芦醇没有降低耐药细胞P-gp的表达。4.自噬抑制剂氯喹(CQ)抑制自噬可以降低K562/ADM细胞对白藜芦醇的敏感性,流式细胞仪检测显示经CQ预处理后,K562/ADM细胞的凋亡率明显下降,而K562细胞的凋亡率略有上升;WB检测结果显示经CQ预处理后自噬标志蛋白LC3、Beclin-1的表达较白藜芦醇单独作用组明显下调,凋亡相关蛋白caspase-3的活化降低,Bcl-2/Bax蛋白表达的比值升高。结论:1.白藜芦醇可诱导K562敏感细胞和K562/ADM耐药细胞自噬活性,且K562/ADM细胞被诱导的自噬活性明显高于K562细胞。2.白藜芦醇通过增强K562/ADM耐药细胞的自噬活性而诱导其凋亡,白藜芦醇的细胞毒效应导致溶酶体膜通透性增加、Cath D释放入胞质、促进Bax介导的线粒体膜通透性与细胞色素c的释放增多、激活Caspase级联反应,最终导致细胞自噬性凋亡。白藜芦醇同样诱导K562敏感细胞自噬和凋亡,但自噬活化只是细胞凋亡的伴随现象。3.K562/ADM耐药细胞的固有ROS水平显著低于K562敏感细胞,且白藜芦醇诱导的ROS增高水平也低于K562细胞。K562/ADM细胞的高基础自噬活性和低ROS水平可能是其耐药性机制之一。4.P-gp可能不参与白藜芦醇诱导K562/ADM耐药细胞自噬活性介导细胞凋亡的调控。