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研究背景：大肠癌是一种在世界范围内的发病率非常高的恶性肿瘤。随着生活水平提高、饮食结构变化，我国大肠癌的发病率呈上升趋势。流行病学统计数据显示，我国已进入大肠癌的高发地区行列，每年新发病例约400,000，其中30-40岁的中青年患者占多数。大肠癌的防治形势严峻。因此，探讨大肠癌的发病机制、寻找大肠癌诊断与治疗相关的靶点，具有非常重要的理论和现实意义。Hedgehog（Hh）信号通路参与胚胎发育、调节细胞增殖与凋亡的平衡，在机体发育过程中扮演重要角色。此外，近年来的研究发现该信号通路在人类多种肿瘤的发生、发展过程中也起重要作用。有研究显示在大肠癌组织中存在Hh信号通路的异常激活。但Hh信号通路如何影响大肠癌发生、发展机制尚不明确。氧化偶氮甲烷（AOM）是一种能特异性诱导大肠癌发生的化学物质，我们采用AOM联合葡聚糖硫酸钠（DSS）构建小鼠大肠癌模型。并利用该动物模型研究Hh信号通路在大肠癌发生、发展中的改变，为研发治疗大肠癌的靶向药物提供新方向。研究目的：1、研究Hh信号通路中SuFu、Gli1及细胞周期调控蛋白Cyclin D1在AOM/DSS诱导的小鼠大肠癌中的表达变化，探讨该模型在研究Hh信号通路对大肠癌发生、发展作用机制的价值。2、通过构建过表达SuFu的小鼠大肠癌稳定细胞系，研究Hh信号通路负性调控因子SuFu对Gli1、Cyclin D1蛋白表达的影响，探讨SuFu在大肠癌形成过程中的作用机制。研究方法：1、AOM/DSS联合诱导构建小鼠大肠癌模型：选用体重20-24g的雌性BALB/c小鼠用于实验，随机分为A/D组、AOM组、DSS组及空白对照组，每组28只。实验第1天，按12mg/kg的剂量向A/D组、AOM小鼠腹腔注射氧化偶氮甲烷（Azoxymethane，AOM），向DSS组、对照组小鼠腹腔注射等体积无菌生理盐水。自第2周开始A/D组、DSS组小鼠每3周饮用3%葡聚糖硫酸钠（Dextran Sulfate Sodium，DSS，分子量：5000）溶液1次，每次1周，连续9周。实验第24周处死小鼠。以肉眼见大肠新生物形成、苏木素/伊红（Hematoxylin Feosin，HE）染色验证肿瘤形成为模型构建成功标志。2、小鼠一般状态的观察和检测（1）实验前9周每周称量各组小鼠体重，观察小鼠饮用3%DSS期间各组小鼠是否出现便血、腹泻等；（2）实验第24周处死小鼠，肉眼观察小鼠大肠大体形态改变，测量大肠长度，HE染色观察病理组织学改变；3、免疫组化检测各组小鼠大肠组织、大肠癌组织中SuFu、Gli1及Cyclin D1蛋白的表达水平。4、SuFu过表达小鼠大肠癌稳定细胞系的构建：（1）构建表达小鼠SuFu真核表达质粒；（2）PEI法将重组质粒pUB6/V5-His-SuFu转染至小鼠大肠癌细胞C26，用Blasticidin筛选稳定表达pUB6/V5-His-SuFu的C26细胞（C26-SuFu），WesternBlot检测外源性SuFu表达；5、Western Blot检测C26-SuFu细胞中Gli1、Cyclin D1的表达水平。实验结果：一、动物实验1、首次饮用3%DSS溶液后，A/D组、DSS组小鼠分别有23/27、24/28只小鼠出现腹泻或便血。第二次饮用3%DSS溶液后，分别有22/27，21/26只小鼠出现腹泻或便血。第三次饮用3%DSS溶液后，分别有17/20、18/23只小鼠出现腹泻或便血。出现腹泻或便血小鼠在恢复自然饮水1周后大便恢复正常。AOM组及对照组始终未出现腹泻、便血。2、首次饮用3%DSS溶液1周后，各组小鼠体重变化的差异有显著统计学意义（F=16.523，p<0.01）。各组小鼠增重如下：A/D组－1.33±1.52g、AOM组0.03±1.03g、DSS组－1.8±1.25g、对照组0.95±0.92g。第二次、第三次饮用3%DSS溶液后，各组小鼠体重变化差异无统计学意义（F=1.968，p>0.05；F=2.557，p>0.05）。3、在实验第7周末，每组小鼠各处死12只，各组小鼠大肠均未见新生物。实验第24周处死小鼠，A/D组小鼠、DSS组小鼠大肠较对照组明显短缩（p<0.05）。A/D组中3只（3/3）小鼠大肠可见新生物，均位于大肠远端；AOM组、DSS组及空白对照组小鼠大肠未见新生物。HE染色显示A/D组小鼠大肠新生物为癌组织；其他各对照组大肠组织腺体结构排列整齐，无异型细胞，部分见少量炎症细胞浸润。4、各组小鼠大肠组织与大肠癌组织中SuFu蛋白的表达差异有统计学意义（H=9.698，p<0.05）。A/D组小鼠大肠癌组织、AOM组小鼠大肠组织中SuFu蛋白的表达水平较对照组高（p<0.05）。A/D组大肠癌组织与AOM组、DSS组之间SuFu蛋白表达水平的差异无统计学意义，AOM组与DSS组、DSS组与对照组之间SuFu蛋白表达水平的差异无统计学意义（p>0.05）。5、各组小鼠Gli1蛋白的表达差异有统计学意义（H=9.663，p<0.05）。A/D组小鼠大肠癌组织中Gli1蛋白表达水平较DSS组、对照组大肠组织高（p<0.05）。A/D组与AOM组、DSS组与对照组之间Gli1蛋白表达水平的差异无统计学意义（p>0.05），AOM组与DSS组、对照组Gli1蛋白表达水平的差异无统计学意义（p>0.05）。6、各组小鼠Cyclin D1蛋白的表达差异有统计学意义（H=10.039，p<0.05）。A/D组小鼠大肠癌组织中Cyclin D1蛋白表达水平较DSS组、对照组大肠组织高（p<0.05）。A/D组与AOM组、DSS组与对照组之间Cyclin D1蛋白表达水平的差异无统计学意义（p>0.05），AOM组与DSS组、对照组Cyclin D1蛋白表达水平的差异无统计学意义（p>0.05）。二、细胞实验1、经PCR鉴定及DNA测序，结果显示pUB6/V5-His-SuFu真核表达质粒构建成功。2、Western Blot检测外源性SuFu，验证稳定表达SuFu小鼠大肠癌细胞系构建成功。3、过表达SuFu的小鼠大肠癌稳定细胞系中Gli1、Cyclin D1的表达水平较对照组低，其差异有统计学意义（p<0.01）。结论：1、AOM/DSS诱导的小鼠大肠癌模型可用于研究Hh信号通路在大肠癌发生、发展中的作用及分子机制。2、稳定表达SuFu的小鼠大肠癌细胞系可用于SuFu在大肠癌形成过程中的作用及机制的研究。3、Hedgehog信号通路在大肠癌形成过程中被异常活化。