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肺癌已是我国因肿瘤致死的首要病因。传统的治疗包括手术,放疗,化疗均缺乏特异性。靶向治疗的兴起大大改善了肺癌患者生存时间和生存质量。然而获得性耐药的发生困扰着靶向治疗的进一步临床应用。因此阐明获得性耐药的分子机制,并在此基础上寻找逆转分子靶向药物获得性耐药的方法,进一步深入研究获得性耐药的相关分子生物学分子机制,成为本论文研究的主要目的。首先根据实验室前期的对吉非替尼敏感细胞PC-9和三株吉非替尼耐药细胞PC-9/AB2,PC-9/AB11,PC-9/BB4的表达谱芯片分析研究结果示:与PC-9细胞相比,三株耐药细胞在细胞周期相关通路Rb-E2Fs信号通路的变化尤为突出。本课题中在收集的临床标本中的免疫组化染色(IHC)证明了肺腺癌与Rb-E2Fs信号通路相关。并且进一步用western-blot证明相较于正常支气管上皮细胞B2B,肺腺癌细胞PC-9,PC-9/AB2和HCC-827细胞周期相关蛋白表现为不同种类和程度的表达异常。因此肺癌的发生和吉非替尼获得性耐药与细胞周期调控异常相关。其次,在吉非替尼敏感细胞(PC-9)和吉非替尼耐药细胞(PC-9/AB2)中应用MTT,EdU,细胞周期和细胞凋亡实验,试探性的将细胞周期抑制剂PD0332991与吉非替尼联合应用逆转其获得性耐药。MTT中,联合用药组细胞的存活率明显低于单药处理组;EdU增殖实验,联合用药组的增值率分别为3.7%(PC-9)和2.1%(PC-9/AB2),明显低于单药处理组;细胞凋亡试验,联合用药组的凋亡率为23.66%(PC-9/AB2),明显高于吉非替尼组的13.2%;细胞周期实验中联合用药组G0/G1抑制率分别为30.6%(PC-9)和23.75%(PC-9/AB2),明显高于各单药处理组。运用基因芯片分析,real-time PCR,western-blot证明细胞周期抑制剂PD 0332991与吉非替尼联合应用逆转吉非替尼的获得性耐药与Rb-E2Fs信号通路的细胞周期密切相关。体内实验,PC-9/AB2裸鼠皮下成瘤模型中PD 0332991与吉非替尼联合用药组,肿瘤缩小的速度及百分比均明显快于其他单药处理组。免疫组化染色联合用药组肿瘤中Ki-67阳性率为3%,TUNNEL阳性率为67%,CD34阳性率为4%,明显较单药处理组和对照组有意义。在临床中选取3位接受吉非替尼治疗进展的患者,在服用吉非替尼的同时,增加PD 0332991的服用。3周后两位患者的病情得到了很好的控制,一位患者头颅转移灶大部分消失,并且骨转移导致的骨痛症状消失。最后,为了进步揭示细胞周期调控产生获得性的耐药和肺癌发生的机制,我们研究了lnc RNA HOATIR在肺癌中的作用。首先在收集的67对肺癌术后组织的基因水平分析发现:肿瘤组织中HOTAIR的表达率为100%,而相对应的癌旁组织的表达率只有42.65%。并且其表达高低与肿瘤的病理分化程度呈反比。证明了HOATIR与肺癌的相关性。进一步的细胞实验中:过表达HOTAIR,细胞周期处在G1期的细胞比例下降,而S期比例升高。EdU增殖实验证明了细胞增值率较对照组平均增加了20%,侵袭率平均增加了30%,转移率增加了50%。而敲低HOTAIR的表达依然有意义。Western-blot和TOP/FOP荧光素酶报告实验证明HOTAIR功能的发挥与Rb-E2Fs信号通路,EMT,β-catenin细胞通路相关。裸鼠原位种植模型,进一步证明了细胞实验的结果。本课题的研究明确了肺腺癌EGFR-TKIs获得性耐药的发生与Rb-E2Fs信号通路异常导致细胞周期的调控异常相关,并且应用CDK4/6抑制剂PD 0332991可以增强吉非替尼的抑瘤作用,逆转吉非替尼的获得性耐药。进一步对肺癌细胞周期的调控异常机制研究中,发现lnc RNA HOTAIR参与肺癌的细胞周期调控,细胞增殖调控,细胞侵袭转移调控,这种调控作用同样与Rb-E2Fs信号通路,EMT,β-catenin细胞通路相关,其可作为新一代细胞周期抑制剂的研究靶点。