卵巢癌是常见的女性生殖系统恶性肿瘤,可发生于任何年龄阶段,在妇科肿瘤中,卵巢癌的病死率位于首位[1]。由于卵巢癌发病隐匿,又缺乏有效的早期诊断技术,导致70%卵巢癌确诊时已处于疾病晚期阶段[2]。目前临床治疗措施主要是手术+化疗+维持治疗(PARP抑制剂),其中化疗仍是卵巢癌治疗的关键手段。70%左右的上皮性卵巢癌对铂类联合紫杉醇化疗敏感,然而随着化疗次数增多,最终出现铂耐药、疾病出现难以控制的进展[3],致使晚期卵巢癌患者的5年生存率仅有30%左右[4]。顺铂是常用的抗肿瘤化疗药物,临床上用于多种实体肿瘤的治疗[5]。目前多数认为顺铂杀灭肿瘤细胞的机制主要是引起DNA损伤、破坏DNA复制和转录而致细胞毒性,间接启动线粒体通路介导的内源性凋亡途径,其中Bcl-2/BAX家族和Caspase家族蛋白的活化发挥至关重要的作用[6]。顺铂为药物剂量-浓度依赖性的抗肿瘤药物,但因其严重的神经毒性、耳肾毒性等严重副作用,限制了铂类药物的大剂量长期应用,另外,长期治疗过程中逐渐出现铂类耐药,限制了铂类药物使用。需要寻找药物与铂类药物联合应用,提高疗效,延缓耐药,降低剂量减轻副作用。近年来随着分子靶向药物在恶性肿瘤治疗中的应用,叶酸代谢通路中的关键酶作为肿瘤治疗的靶点逐渐受到关注。培美曲塞是一种新型多靶点抗叶酸代谢药物[7],体外研究显示,培美曲塞主要抑制胸苷酸合成酶(TS),对二氢叶酸还原酶(DHFR)、甘氨酰胺核苷酸甲酰转移酶活性也有一定的抑制作用,导致嘌呤和嘧啶合成障碍,从而抑制DNA复制、阻滞细胞于S期。多项临床研究显示培美曲塞与化疗药物联用对恶性胸膜间皮瘤、肺癌、乳腺癌等多种肿瘤具有抗瘤活性[8]。培美曲塞通过细胞膜上的叶酸结合蛋白运输系统进入细胞内[9],其抗肿瘤治疗的效应可能与叶酸受体的表达的高低有关。目前发现的叶酸受体有三种亚型[10],分别为叶酸受体-α(FR-α)、叶酸受体-β(FR-β)、叶酸受体-γ(FR-γ)。其中FR-α的高表达与人类肿瘤进展、化疗耐药相关[11]。FR-α位于细胞外膜[12],通过胞饮机制将叶酸转运到细胞内,通过胸苷酸合成酶(TS)等参与噪呤、嘧啶的合成。YU等[11]实验研究表明,FR-α在正常卵巢、卵巢良性病变的血清、组织不表达或者低表达,而在上皮性卵巢癌中呈现高表达状态,大多数表达于浆液性卵巢癌。FR-α高表达通过加强嘌呤、嘧啶的合成作用,促进肿瘤细胞DNA复制及损伤修复、导致肿瘤细胞的耐药。有资料显示FR-α高表达可能是培美曲塞抗肿瘤治疗的有效生物学标记[13]。当与顺铂联用时,一方面使顺铂所致肿瘤细胞DNA损伤不能修复、增强顺铂化疗的敏感性;另一方面通过阻止DNA复制抑制肿瘤细胞增殖[14]。本实验旨在研究抗叶酸代谢药物培美曲塞与顺铂联用,对卵巢癌SKOV3细胞增殖、凋亡、侵袭的影响及相关机制,为临床卵巢癌的治疗提供新的思路。目的通过qRT-PCR技术、Western Blot法检测中国仓鼠卵巢上皮细胞CHO、卵巢癌SKOV3细胞中FR-α及胸苷酸合成酶(TS)的mRNA及蛋白水平,并着重研究培美曲塞联合顺铂对卵巢癌SKOV3细胞增殖、凋亡、侵袭的影响及其可能机制。研究对象和实验方法1.研究对象:中国仓鼠卵巢上皮细胞CHO、卵巢癌SKOV3细胞。2.研究方法:qRT-PCR技术、Western Blot法检测中国仓鼠卵巢上皮细胞CHO、卵巢癌SKOV3细胞中FR-α mRNA、蛋白及TS mRNA、蛋白水平;MTT、Annexin V-FITC和PI双染法结合流式细胞术、Transwell检测培美曲塞、顺铂及培美曲塞联合顺铂对SKOV3细胞的增殖、凋亡、侵袭的影响;Western blot实验检测培美曲塞、顺铂及联合使用时对BAX、Bcl-2蛋白表达的影响,同时Western Blot法检测SKOV3细胞加入培美曲塞前后TS、FR-α蛋白的变化。3.统计学方法:采用SPSS24.0进行统计分析。正态分布计量资料用x±s表示,非正态分布定量资料用M(P25～P75)表示,应用两独立样本t检验分析两组定量资料,培美曲塞、顺铂及联合使用对SKOV3侵袭及凋亡的影响采用单因素方差分析,检验水准α=0.05。结果1.FR-α 蛋白(0.46±0.04)、TS 蛋白(0.34±0.03)在卵巢癌 SKOV3 细胞,与中国仓鼠卵巢上皮细胞CHO中的FR-α蛋白(0.12±0.02)、TS蛋白(0.19±0.02)相比,差异均具有统计学意义(P<0.001);FR-α mRNA(3.73±1.50)、TS mRNA(1.77±0.48)在卵巢癌SKOV3细胞,与中国仓鼠卵巢上皮细胞CHO中的FR-αmRNA(0.90±0.38)、TS mRNA(0.75±0.29)相比,差异均具有统计学意义(P<0.01)。2.在体外采用不同浓度(10mg/L、20mg/L、40mg/L、80mg/L、160mg/L、320mg/L、640mg/L、1280mg/L)的培美曲塞处理 SKOV3,不同浓度(0.75mg/L、1.5mg/L、3mg/L、6mg/L、12mg/L)的顺铂处理SKOV3。结果显示培美曲塞、顺铂对SKOV3细胞的增殖抑制作用均呈剂量浓度依赖性,培美曲塞IC50值为(597.53±113.27)mg/L,顺铂 IC50 值为(8.23±0.79)mg/L。6mg/L 顺铂的增殖抑制率为(25.57±0.94)%,320mg/L培美曲塞的增殖抑制率为(34.82±1.64)%,二者联合的抑制率为(50.00±1.40)%,差异具有统计学意义(P<0.001),选取为6mg/L顺铂、320mg/L培美曲塞作为后续实验浓度。3.侵袭结果表明,培美曲塞组平均侵袭细胞数(53.11±4.17)个,顺铂组平均侵袭细胞数(43.89±3.69)个,培美曲塞+顺铂组平均侵袭细胞数(26.22±2.99)个,对照组平均侵袭细胞数(73.44±6.16),经单因素方差分析结果显示:联合用药组较单药组相比,差异具有统计学意义(P<0.001)。单药组较对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.001)。4.凋亡结果表明,培美曲塞组细胞凋亡率为(17.46±0.84)%,顺铂组凋亡率为(20.50±0.93)%,而联合使用凋亡率则增加到(36.41±2.07)%,经过单因素方差分析结果显示,联合用药组细胞凋亡率明显大于单药组,且差异具有统计学意义(P<0.001),单药组较对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.001)。5.Western blot结果表明,Bcl-2蛋白在顺铂组(0.25±0.03)、培美曲塞组(0.31±0.02)、顺铂+培美曲塞组(0.12±0.01),对照组(0.49±0.03);BAX蛋白在顺铂组(0.42±0.04)、培美曲塞组(0.37±0.03)、顺铂+培美曲塞组(0.61 ±0.04),对照组(0.16±0.02)。联合用药组的BAX、Bcl-2蛋白表达水平较顺铂组相比,差异均具有统计学意义(P<0.001)。6.Western blot结果表明,加入培美曲塞后SKOV3细胞中的TS蛋白(0.34±0.03),较SKOV3细胞中的TS蛋白(0.25±0.02)相比,差异具有统计学意义(P<0.001),而FR-α蛋白无明显变化。结论1.培美曲塞抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖、诱导凋亡、减弱细胞侵袭,与顺铂联合具有协同作用。2.在卵巢癌SKOV3细胞中FR-α、TS蛋白呈现高表达状态,培美曲塞可降低TS蛋白的表达。3.培美曲塞联合顺铂可能通过降低叶酸代谢通路中TS蛋白的表达抑制DNA复制及损伤修复,激活线粒体通路介导的内源性凋亡途径,从而为顺铂化疗起到增敏作用,为治疗卵巢癌提供新的思路。