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软组织损伤创面在合并糖尿病、放射治疗等情况下,常常延迟愈合、不愈、或反复发作,转变为慢性难愈性创面,成为长期困扰临床治疗的一大难题。通常采用的皮肤移植疗法,无论自体还是异体皮都受到供体来源少的限制,异体皮和人工合成皮还存在免疫排斥等问题。创面愈合受抑的原因是多方面的,包括迁移至创面的炎细胞数量减少、生长因子合成降低以及胶原形成障碍等。骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)是来源于骨髓的多能干细胞,可以向多种细胞分化,如成纤维细胞、骨、软骨、肌肉和神经细胞等。BMSCs还可以分泌很多与创面愈合有关的细胞因子和生长因子。其来源广泛,获取方便,体外扩增能力强,成为细胞治疗和基因治疗遗传性或获得性疾病的焦点。血小板源性生长因子(PDGF)储存在循环血小板的а颗粒中,创伤时,由血凝块首先释放,随后在愈合过程中由巨噬细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞、平滑肌细胞和表皮细胞合成分泌,参与创面的修复,被称为“损伤修复因子”。重组PDGF产品Becaplermin,已经被美国FDA批准用于糖尿病溃疡的治疗。长期处于开放状态的慢性创面,很容易变成各种微生物的培养基,从而阻碍愈合进程,甚至出现全身副作用,因此防治创面感染无论对局部创面愈合还是全身副作用的预防都是有利的。人β防御素2(human beta defensin2,hBD2)作为天然抗微生物肽,对革兰阴性菌有很强的杀菌作用,对革兰阳性菌也有明显的抑菌效果。血小板源性生长因子和防御素分别作用于创伤愈合的不同靶点,若联合应用可能会有协同作用。本研究拟构建hPDGF-A和hBD2双基因共表达腺病毒载体,转染BMSCs,以期在局部用于慢性创面时,能在一定时间内持续大量合成释放hPDGF-A和hBD2,协同发挥促愈作用。主要方法和结果如下:1.hPDGF-A/hBD2双基因共表达腺病毒载体的构建和鉴定。以含有hPDGF-A cDNA全长序列的质粒pLXSN-hPDGF-A为模板,PCR扩增两端含EcoRⅠ/BamHⅠ酶切位点的hPDGF-A基因,然后插入到pIRES2-EGFP的多克隆位点。以此重组子为模板,PCR扩增hPDGF-A-IRES序列,产物插入质粒pAdTrack-CMV-hBD2_的BglⅡ/ NotⅠ酶切位点之间,此重组子经PmeⅠ线性化后与骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183细胞中进行同源重组,PacⅠ酶切鉴定阳性重组质粒,脂质体法转染293细胞包装出含hPDGF-A/hBD2的腺病毒颗粒,命名为Adv-hPDGF-A-IRES-hBD2。采用RT-PCR、免疫荧光细胞化学和Western-blot方法证实重组腺病毒感染BMSCs后,能成功表达外源基因hPDGF-A和hBD2。2.Adv-hPDGF-A-IRES-hBD2感染骨髓间充质干细胞后表达产物活性鉴定。分别收集正常(N)、转染空腺病毒(C)以及转染重组腺病毒(T)BMSCs的无血清培养上清。制备大鼠第三代BMSCs单细胞悬液,调整密度到1×10~4个/ml,传代培养至7块96孔板,每板30孔,每孔200μl,24h细胞贴壁后,更换收集的培养上清,每组10孔。MTT法每天检测细胞光密度值(OD值),结果显示在第2d、3d和5d,T组OD值和其它两组比较有显著差异(p<0.05),在第4d差异非常显著(p<0.01),表明重组腺病毒感染BMSCs后,表达的外源基因hPDGF-A有促进细胞增殖的作用;将10T1/2细胞株传代培养至六孔板,待细胞融合达80%左右时,用无菌10μl枪头沿培养板底部呈“一”字形划痕,PBS洗涤后,分别更换上述三种培养上清,在0h、4h、8h、12h、24h和30h镜下观察并照相。结果显示和其它两组比较,添加T组培养上清的细胞划痕在8～30h时,其愈合面积百分比显著高于其它两组(p<0.05),表明重组腺病毒感染BMSCs后,表达的外源基因hPDGF-A有促进细胞迁移的作用;对上述三种培养上清进行冷冻干燥、重溶,获取20倍浓缩液,然后采用K-B纸片法观察其对大肠埃希菌EC(ATCC 25922)、金黄色葡萄球菌SA(ATCC 25923)和绿脓杆菌PA(ATCC 27853)标准菌株的抗菌效应。结果显示,T组培养上清浓缩液在添加胰酶后出现显著抑菌环,其它组没有明显的抑菌环。表明重组腺病毒染BMSCs后,表达的外源基因hBD2在胰酶作用下显示抑菌作用。3.Adv-hPDGF-A-IRES-hBD2感染的骨髓间充质干细胞局部移植后对放创复合伤创面修复的影响。复制大鼠放创复合伤模型,以局部点状注射移植感染重组腺病毒的BMSCs组为实验组(T组),以注射PBS(N组)和移植正常BMSCs组(C组)为对照组。在移植后1d、3d、7d、14d、21d和28d,大体观察创面愈合情况,同时测定痂下菌量、残留面积以及愈合时间。各时相点分别取材,冰冻切片在荧光显微镜下观察BMSCs在创面的分布情况;石蜡切片经HE染色,观察时创面的病理形态变化,石蜡切片经Sirus Red染色后,偏振光显微镜下观察胶原纤维含量的变化,免疫组织化学染色观察外源基因hPDGF-A/hBD2的表达情况。结果显示,大体观察,在各时相点,与N组和C组比较,T组创面感染程度较轻,愈合速度较快,创面平均愈合时间为21～22d,而N组和C组分别为24～25和27～28d。伤后3d,T组痂下菌量少,和对照组相比有显著差异(p<0.05),7d、14d和21d时差异非常显著(p<0.01)。伤后3d,三组间残留面积百分比无显著统计学差异(p>0.05),在7d、14d和21d时,T组残留面积百分比明显小于N组(p<0.01)和C组(p<0.05)。HE染色结果证实T组愈合速度快于N组和C组。胶原纤维Sirus Red染色结果表明:在7d、14d、21d时,T组胶原染色比N组和C组明显较强。荧光显微镜观察结果显示,至少在移植后两周之内BMSCs可以较高水平地表达以EGFP为指示的外源基因。创面免疫组织化学观察到,外源基因从第3d开始表达,第7d达到高峰,第21d仍有少量表达。