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目的利用兔关节软骨细胞和骨髓间充质干细胞（bone marrow messenchymal stemcells，BMSCs）建立共培养系统，探讨关节软骨细胞和BMSCs在体外平面环境下共培养促进软骨细胞外基质表达的最佳比例，以及在体内外三维环境中共培养构建组织工程软骨的最佳比例。方法1.取新西兰大白兔骨髓，采用密度梯度离心法分离单核细胞，体外贴壁培养，筛选至第2代BMSCs。倒置相差显微镜观察细胞形态，流式细胞仪检测细胞表面标志物的表达。同时用成脂诱导培养基（DMEM/F12，10%FBS，1μmol/LDEX、0.5mmol/L IBMX、5mg/L人胰岛素，100μmol/L吲哚美辛），成骨诱导培养基（DMEM/F12，10%FBS，100nmol/L DEX、10mmolβ-磷酸甘油钠、50ug/mlVc）和成软骨诱导培养基（DMEM/F12，10%FBS, 1%ITS+，10ng/mL TGF-β1，0.1μM DEX和50μg/ml Vc）对BMSCs进行定向诱导。利用油红O染色检测成脂诱导效果，利用碱性磷酸酶染色检测成骨诱导效果，利用番红O染色和甲苯胺蓝染色检测成软骨诱导效果。2.分别分离培养兔关节软骨细胞和兔BMSCs至第2代。实验分为8组，分别为：单纯关节软骨细胞组（C），4:1共培养组（软骨细胞:BMSCs=4:1），2:1共培养组（软骨细胞:BMSCs=2:1），1:1共培养组（软骨细胞:BMSCs=1:1），1:2共培养组（软骨细胞:BMSCs=1:2），1:4共培养组（软骨细胞:BMSCs=1:4），单纯BMSCs诱导分化组（iM，DMEM/F12，10%FBS, 1% ITS+，10ng/mL TGF-β1，0.1μM DEX和50μg/ml Vc）和BMS Cs未诱导组（M）。各组均以相同的细胞总数（10~5）接种于培养皿。分别于共培养后第1周，第2周和第3周，提取标本的mRNA和蛋白质。利用Quantitative real-time RT-PCR和Western blot检测II型胶原和aggrecan的mRNA和蛋白质的表达量，以及I型胶原mRNA的表达量。3.分别培养扩增兔关节软骨细胞和BMSCs至第2代。待细胞80%融合时消化细胞调整细胞悬液浓度为4×10~7/ml并将两种细胞混合，实验分为8组，设组与第二部分实验相同。将上述各组分别接种于4×4×2mm大小的聚乳酸-聚羟基乙酸支架（PLGA）上，每组种植16个支架，每个支架种植细胞总数（10~7）相同。体外培养8周后，各组均取出8个标本进行大体观察、组织学切片、II型胶原免疫荧光染色以及检测组织标本DNA含量和氨基糖胺多糖（GAG）含量。将剩余标本移植于裸鼠皮下继续培养8周，并在培养结束后进行大体观察、组织学切片、II型胶原免疫荧光染色以及检测组织标本DNA含量和氨基糖胺多糖（GAG）的含量。结果1.经密度梯度离心结合贴壁培养传代所得到的细胞形态均一，呈长梭形，接近融合状态时可呈现漩涡样生长。分离传代后的第2代细胞超过98%表达CD44、CD29，仅约5%表达CD34。兔BMSCs成脂，成骨和成软骨诱导培养后，油红O，碱性磷酸酶染色，番红O和甲苯胺蓝染色均为阳性。2.共培养组aggrecan和II型胶原的表达量在1周，2周和3周时呈现出明显的增长趋势。方差分析显示在mRNA水平第3周时，4:1组、2:1组、1:1组的II型胶原和aggrecan都高于单纯关节软骨细胞组和BMSCs诱导组，其中以2:1组最高（P<0.05）。在蛋白质表达水平第3周时2:1组的II型胶原和aggrecan均高于单纯关节软骨细胞组和BMSCs诱导组（P<0.05）。3.在体外和体内环境下培养组织工程软骨标本显示，软骨细胞与BMSCs以2:1混合的共培养组构建出的组织工程软骨体积最大，厚度厚，形态饱满，表面光滑有光泽，弹性好；HE染色可见细胞分布均匀排列紧密，增殖较旺盛，并可见软骨细胞陷窝样结构，细胞被大片细胞外基质包围；番红O染色可见细胞外基质红染，着色深；甲苯胺蓝染色则细胞外基质蓝染，着色为蓝紫色；II型胶原免疫荧光组织化学染色中，细胞外基质发出的红色荧光明亮，并显示出有陷窝状结构；2:1组的GAG/DNA比值高于关节软骨细胞组和其他各组（P<0.05）。4:1共培养组和关节软骨细胞组的组织工程软骨质量无明显差异，但差于2:1组。1:1组，1:2组，1:4组的质量随着开始时BMSCs所占比例的增加而下降，体积小，表明不光整，质地较硬，GAG/DNA较低。BMSCs诱导培养组在体外培养构建的工程化软骨与1:1组接近，而在体内培养后构建的工程化软骨与1:4共培养组接近。BMSCs未诱导组在体外培养第5周时支架溶解，细胞流失，未能形成工程化软骨。结论我们提取BMSCs的方法操作简便易行，所获取的细胞符合BMSCs的特点。在体外单层平面环境下，共培养兔关节软骨细胞和BMSCs在一定比例范围内能促进关节软骨细胞外基质的表达，其中以兔软骨细胞和BMSCs按2:1的比例混合培养促进aggrecan和II型胶原的效果最为明显。在体内和体外环境下构建的组织工程软骨，仍以2:1的比例混合后共培养所构建的组织工程软骨质量最好。