【第一部分】构建奥曲肽靶向性p H/GSH双响应型负载依托泊苷的纳米递送体系一、背景和目的神经内分泌肿瘤（neuroendocrine neoplasms,NENs）是异质性非常强的肿瘤,来源于神经内分泌细胞和肽能神经元,可分布于胃、肠、胰腺、肺、纵膈等全身多个器官,2017年JAMA Oncol杂志报道在过去30年里美国NENs年发病率快速增长至6.98/10万,增长近6倍。中国胃肠胰神经内分泌肿瘤专家共识中依据Ki-67指数和核分裂象,将NENs区分为分化较好的神经内分泌瘤（NET）和分化差的神经内分泌癌（NEC）。NEC患者预后与腺癌、鳞癌类似,治疗以依托泊苷和顺铂、奥沙利铂和卡培他滨等方案化疗为主。而化疗药物通常静脉输注后作用于全身,常可导致恶心、呕吐等胃肠道反应、骨髓抑制、肝肾功能损害等,严重影响患者的生存质量。既往研究表明,NENs肿瘤细胞表面常高表达生长抑素受体（Somatostatin receptor,SSTR）,而奥曲肽可与SSTR结合从而发挥其治疗作用。多功能聚合物纳米胶束载体被用作化疗药物的运送,具有改善生物相容性、延长保留时间和增强治疗功效、缓解化疗药物的全身毒副反应等许多巨大优势。本研究的目的即基于奥曲肽-SSTR结合构建多功能聚合物纳米胶束载体用于细胞毒药物依托泊苷（ETO）的递送,从细胞及动物水平观察其在NENs肿瘤细胞的聚集浓度,检测其抗肿瘤活性及毒副反应。二、材料与方法胱胺二盐酸盐和四苯基乙烯（TPE）用柱层析法纯化获得TPE-SS-NH2,再使用甲氧基聚乙二醇-b-聚γ-苄基-L-谷氨酸（m PEG-b-PBLG）和羧基聚乙二醇胺-b-聚γ-苄基通过开环聚合合成-L-谷氨酸盐（HOOC-PEG-b-PBLG）,将后者与奥曲肽（OCT）缀合得到OCT-PEG-b-PBLG,再将二者脱保护,得到m PEG-b-PLG和OCT-PEG-b-PLG,核磁共振氢谱分析验证这两个化合物。随后将它们用TPE-SS-NH2、3-氨基苯硼酸（BA）和3,4-二羟基苯乙胺（DA）修饰,获得m PEG-b-PBLG和HOOC-PEG-b-PBLG,再将Oct缀合上去,获得m PEG-b-PGu（BA-TPE）和OCT-PEG-b-PGu（DA-TPE）,最后通过形成硼酸酯键来制备核心交联胶束（CCLM）,m PEG-b-PGu（BA-TPE）制备未交联的胶束（UCLM）作为对照组。用二甲基亚砜（DMSO）稀释CCLM后给予365nm紫外光照射,检测其散射光强度变化及抗光猝灭性,通过动态光散射探讨不同条件下CCLM的平均大小和多分散指数。通过纳米沉淀和透析方法将ETO负载到胶束中。三、结果m PEG-b-PBLG和HOOC-PEG-b-PBLG的分子量分别为9.2和10.5 kDa,通过GPC法测量的其分子量分别为11.1和12.3 k Da。m PEG-b PGu（BA-TPE）和OCT-PEG-b-PGu（DA-TPE）的接枝率分别为38.6%和33.4%,临界胶束浓度分别约为3.41μg/m L和7.35μg/m L。核磁共振氢谱分析验证均观察到典型信号峰,CCLM显示出范围较小的尺寸分布,平均尺寸为175.3 nm,在365nm的紫外光照射下可清楚地观察到由聚集的TPE产生的荧光,并可以保持DMSO稀释时的结构稳定性,且抗光猝灭性增强。随着p H由7.4降为5.0,CCLM的平均尺寸由稳定逐渐变得波动增大,加入2 m M谷胱甘肽（GSH）时CCLM的平均尺寸和多分散指数均表现出较大的波动,最终稳定在较高水平。负载ETO的CCLM的平均大小为274.6 nm,大于CCLM胶束本身的大随着p H值的降低（7.4、6.0和5.0）,ETO释放变得更快,其54小时的累放分别为24.6%,33.5%和50.4%（p＜0.05）。与20μM GSH相比,在2 m M G条件下ETO释放加快,且随着p H值的降低,GSH的影响逐渐增强。在p H和2 m M GSH条件时药物释放累积ETO释放量高达84.1%（p＜0.01）。在GSH为0的条件下,随着p H值的降低（7.4、6.0和5.0）,ETO释放变得更快,其54小时的累积释放分别为24.6%,33.5%和50.4%（p＜0.01）。而与20μM GSH相比,在2 m M GSH条件下ETO释放加快,且随着p H值的降低,GSH的影响逐渐增强（p＜0.05）。在p H 5.0和2 m M GSH条件时药物释放累积ETO释放量高达84.1%（p＜0.01）。四、结论基于与NENs肿瘤细胞表面SSTR主动靶向结合的OCT成功构建负载ETO的p H和GSH双刺激响应型纳米胶束载药体系,并通过核磁共振氢谱实验、散射光强度检测等实验验证了胶束构建成功,并通过AIE成像证明其可以发生聚集且在血液循环中保持稳定,并在不同的p H和GSH浓度下双刺激响应性释放出来。【第二部分】负载依托泊苷的p H/GSH双响应型纳米载药体系在NENs中的抗肿瘤作用一、背景和目的虽然纳米材料的小粒径有利于其通过实体肿瘤组织穿透效应富集在肿瘤组织,但由于个体敏感性差异等多样化、复杂化的因素,它们对于人体各个系统器官的毒副作用需要重视。而载药的生物纳米颗粒对肿瘤细胞的杀伤仍需要靠影响细胞周期、凋亡等生物学行为来发挥作用。因此,本部分研究的目的在于观察上述负载ETO的CCLM对人体心脏、肝脏、肾、肺、脾等多个器官的毒副反应;在体内外实验中观察该纳米胶束载药后在NENs肿瘤细胞的聚集浓度与游离ETO的区别,检测其对NENs肿瘤细胞周期和凋亡的影响,验证其抗肿瘤作用。二、材料与方法1.采用免疫荧光方法检测SSTR在NENs细胞系BON-1,LCC-18和NCH-446中的表达信号;2.采用流式细胞技术对比观察负载ETO的CCLM较游离ETO对NENs细胞周期的影响的差异;3.通过Annexin V-FITC染色法和TUNEL染色法评估负载ETO的CCLM与游离ETO对NENs细胞凋亡影响的差异。4.使用CCK-8分析来评估NENs细胞的活力,免疫组化染色法检测Ki-67增殖指数。5.构建小鼠异种移植瘤模型,用小鼠三维成像方法在体内观察负载ETO的CCLM较游离ETO在肿瘤组织中聚集的差异,及其对NENs细胞周期、凋亡影响的差异。三、结果1.OCT预处理的NENs细胞系BON-1,LCC-18和NCH-446细胞可结合SSTR2并显示出荧光信号,无OCT处理的胶束则没有明显的荧光信号。2.m PEG-b-PGu（BA-TPE）和OCT-PEG-b-PGu（DA-TPE）组肿瘤细胞存活率均高于90%;ETO和负载ETO的CCLM明显抑制了NENs细胞的活力（p＜0.05）,尤其是负载ETO的CCLM对BON-1细胞表现出了更为明显的抑制作用,但在LCC-18和NCH-446细胞上,游离ETO的细胞毒性却比负载ETO的的CCLM更高（p＜0.01）。3.负载ETO的CCLM注射后第12和24小时可以在肿瘤组织中观察到体内荧光图像,肿瘤组织中的荧光强度在12 h时明显增强;在24小时,肿瘤组织中的荧光强度进一步增加。此外,肝脏中荧光强度也表现为逐渐增加（p＜0.05）。4.小鼠异种移植瘤模型中游离ETO和负载ETO的CCLM组的成瘤体积分别为374和480 mm3,而对照组（生理盐水）则约为1000 mm3（p＜0.001）。在游离ETO处理的小鼠中可以观察到明显的体重减轻,相比之下,在对照组和负载ETO的CCLM组治疗的小鼠,仅能观察到轻微的体重减轻,显示出更低的全身毒性（p＜0.01）。通过H＆E染色未发现心脏、脾脏和肺部有明显异常。与游离ETO相比,负载ETO的CCLM处理的小鼠肝脏和肾脏中仅观察到较小的毒性。5.BON-1细胞停滞在G1期比例从对照组的47.5%显著增加到游离ETO和ETO-CCLM的96.92%和96.08%。LCC-18细胞中停滞在S期的比例从对照的29.48%增加到游离ETO组和ETO-CCLM组的64.12%和68.98%,在NCH-446细胞中停滞在G2期的比例分别从对照的25.85%增至游离ETO和ETO-CCLM的72.56%和72.88%。6.游离的ETO和ETO-CCLM均显著增加了早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞的比率,总凋亡细胞的比例从BON-1细胞中对照组的9.69%增至62%和61.6%,在LCC-18细胞中从16.75%增至90.9和87.8%,在NCH-446细胞中从11.43%增至42.45和45.75%。通过TUNEL分析,负载ETO的CCLM比游离ETO更有效地诱导了肿瘤细胞凋亡。四、结论体内外实验的结果均表明,通过SSTR介导的内吞作用,NENs细胞可以有效地吸收负载ETO的CCLM,体内荧光成像通过聚集诱导发光效应可以验证了负载ETO的CCLM较游离的ETO更为明显的聚集在肿瘤组织部位,显著阻止了肿瘤细胞进入G1/S/G2期,并诱导了凋亡细胞,这表明负载ETO的CCLM与游离ETO相比具有相当大的抗肿瘤活性,减轻全身性毒副反应。这种纳米聚合物胶束系统显示了在NENs治疗上的巨大潜力。