p53是人类肿瘤中发生变异频率最高的基因，在超过50％的自发肿瘤中都存在p53的突变或缺失，p53在多种肿瘤的生物学行为中均起着重要的调控作用。p63是近年来发现的继p73后的p53基因家族又一新成员，在DNA序列上与p53高度同源。由于转录时启动子的不同及C末端的选择性拼接，p63有6种亚型蛋白，分别为具有N端转录激活结构域的TAp63（包括TAp63α，TAp63β及TAp63γ）和缺失N端转录激活结构域的ΔNp63（包括ΔNp63α，ΔNp63β及ΔNp63γ）。p63的各种亚型对p53功能及细胞周期调控的影响存在差异，TAp63表达水平的提高可以促进细胞凋亡，起到抑癌基因功能；ΔNp63的过表达则抑制细胞凋亡，起到原癌基因作用。近期研究表明p63的功能还表现在发育调控上，p63是外胚层、面部和四肢发育的一个关键调控因子。在人类及小鼠中发现p63基因突变可造成至少5种发育紊乱性综合症：即先天性缺指（趾）畸形、外胚层发育不良、唇裂／腭裂综合症（EEC，ectrodactyly-ectodermal dysplasia and cleft lip／palate syndrome，OMIM604292）；眼睑融合-外胚层缺陷-唇裂／腭裂综合症（AEC，ankyloblepharon-ectodermal defects cleft lip／palate syndrome，OMIM106260）；肢体乳综合症（LMS，limb-mammary syndrome，OMIM603543）；肢端-皮肤-爪-泪-齿综合症（ADULT,acro-dermato-ungual-lacrimal-tooth syndrome，OMIM103285）和拉普-霍奇综合症（RHS，Rapp-Hodgkin syndrome，OMIM129400）。此外，最近发现两种非典型综合症也因p63基因突变所致：即手／足裂畸形（SHFM4，split hand／foot malformation，OMIM 6052）和非综合症唇裂（NSCL，non-syndromic cleft lip）。鉴于p63在肿瘤发生及发育调控过程中的重要功能，其相关研究正成为近年来的热点。目前，人们对p63各亚型蛋白结构与功能的研究相对较少，此外尚无有关p63基因原核表达的报道。本论文对小鼠TAp63γ在原核系统中的表达、纯化、结构及功能开展了较系统的研究，并取得了相应的研究结果。首先，根据小鼠TAp63γ基因序列，设计特异引物，克隆到小鼠TAp63γcDNA，并构建得到了其原核表达重组质粒pGEX-2TK-TAp63γ。继而以构建的pGEX-2TK-TAp63γ重组表达质粒为母本，采用基因删除法得到小鼠TAp63γ两种缺失突变体的原核表达重组质粒（分别命名为pGEX-2TK-TAp63γDM1和pGEX-2TK-TAp63γDM2）。将所得到的重组表达质粒（pGEX-2TK-TAp63γ、DGEX-2TK-TAD63γDM1、DGEX-2TK-TAp63γDM2及pGEX-2TK）分别转化感受态E．coli BL21（DE3），IPTG诱导了GST-TAp63γ、GST-TAp63γDM1、GST-TAp63γDM2及Sj26GST的可溶性表达。随后探讨了融合蛋白（GST-TAp63γ）的最适表达条件（包括诱导时间、IPTG浓度、温度、培养基及一些外源小分子对表达的影响），在最适条件下诱导表达的菌液经离心收集菌体、超声破碎及Triton X-100增溶后获得可溶性表达蛋白粗提液，此蛋白粗提液经Glutathione Sepharose 4 Fast Flow亲合层析一步纯化后得到电泳均一的融合表达蛋白（GST-TAp63γ）。采用类似方法在最适条件下表达并纯化得到GST-TAp63γDM1、GST-TAD63γDM2及Sj26GST蛋白。将其中的融合蛋白GST-TAp63γ用蛋白酶（Thrombin）在最适条件下酶切并进行酶切后进一步纯化，得到去GST表达标签的TAp63γ蛋白。所制备的蛋白样品经纯度及浓度检测后，分装低温保存，备用。第二，以上述纯化得到的蛋白样品用于蛋白质结构与热稳定性研究。紫外吸收光谱测定表明TAp63γ在275 nm处有一特征紫外吸收峰；荧光发射光谱检测显示TAp63γ为典型的B类蛋白，荧光3-D扫描表明TAp63γ在340 nm处有一特征荧光发射峰；远紫外圆二色谱测定表明TAp63γ二级结构中富含α螺旋和β折叠，近紫外圆二色谱测定显示TAp63γ分子中富含二硫键。热稳定性研究表明TAp63γ对热不敏感，在75℃保温30 min后仍保持有大部分的可溶性；荧光淬灭研究表明，随着温度升高TAp63γ的特征荧光发射峰强度持续减小，在65℃及以下，荧光淬灭不明显，温度高于65℃时荧光淬灭显著加强；热诱导的远紫外圆二色谱测定表明，随着温度升高，TAp63γ分子中α螺旋含量减少，而无规卷曲含量增加；测定不同温度下TAp63γ与靶DNA结合活性表明，随着温度升高，其DNA结合活性减弱，但在50℃时仍表现出一定的DNA结合能力。化学交联法对TAp63γ聚合态分析表明，在体内其活性态可能是二聚体或四聚体，而Sj26GST主要为二聚体形式存在。同时借助蛋白色氨酸荧光发射光谱检测到Sj26GST的构象变化，结果显示脲处理后Sj26GST发生可逆变性，其构象变化为一步转变模式，变性曲线分析表明脲诱导的蛋白平衡态去折叠／重折叠过程中的变性自由能ΔG=34.46±0.16 kcal／mol，变性自由能对变性剂（脲）浓度的依赖性常数m=5.95±0.02 kcal／mol／M；进一步利用光谱手段测定了重金属汞离子(Hg²⁺)与Sj26GST的相互作用，紫外差谱测定表明Hg²⁺诱导了Sj26GST紫外区LMCT带的出现，随着Hg²⁺浓度的升高，LMCT带强度增大；荧光淬灭检测显示Hg²⁺对Sj26GST特征荧光发射峰有明显的淬灭作用，随着Hg²⁺浓度的增大，Sj26GST特征荧光发射峰强度持续减小，但最大发射峰的位置基本不变；圆二色谱测定表明，Hg²⁺微扰了Sj26GST的二级结构及高级结构，表现为α螺旋的含量略微减少，而无规卷曲含量有所增加，总体表现为Sj26GST高级结构变得更加疏松；抑制动力学测定表明，Hg²⁺对Sj26GST的抑制类型为非竞争性抑制，抑制常数（Ki）为1.64 mmol／L。第三，以纯化的GST-TAp63γ及Sj26GST蛋白分别免疫新西兰白兔，制备得到了两种蛋白的兔抗多克隆抗体。免疫双扩散、免疫印迹及免疫沉淀检测均证实制备得到了特异性高的兔抗GST-TAp63γ及兔抗Sj26GST多克隆抗体。此制备的兔抗GST-TAp63γ及兔抗Sj26GST多克隆抗体应用于TAp63γ与靶DNA和靶蛋白相互作用研究中均取得较好效果，这些抗体的获得为下一步对TAp63γ做深入研究作好了铺垫。最后，利用生物信息学方法及实验手段探讨了小鼠TAp63γ与靶DNA及靶蛋白间的相互作用。凝胶滞留分析（EMSA）表明仅野生型TAp63γ蛋白能特异结合p53靶序列（PG），且在50℃下仍保持有一定的结合活性，而其两种缺失突变体（TAp63γDM1和TAp63γDM2）都不能结合靶序列；为解释此现象，进一步借助生物信息学方法从分子水平上对TAp63γ的DNA结合结构域（DBD）进行了多重序列比对及同源建模，分析表明TAp63γDBD一级结构的完整性、关键氨基酸的保守性及三维结构的相似性可能是其保持DNA结合活性所必需的；对野生型TAp63γ的DNA结合活性作EMSA的Antibody supershift assay检测，结果表明生成了抗体—蛋白—探针三元复合物。同时利用GST沉淀技术研究了小鼠TAp63γ与小鼠p19ARF蛋白间的相互作用，结果显示能形成Glutathione Sepharose—GST-TAp63γ—p19ARF沉淀复合物，而不能形成Glutathione Sepharose—GST—p19ARF沉淀复合物，说明TAp63γ与p19ARF在体外能发生相互作用；同时借助免疫共沉淀技术分析小鼠TAp63γ与小鼠p19ARF蛋白间的相互作用，结果表明能形成抗体—GST-TAp63γ—p19ARF沉淀复合物，而不能形成抗体—GST—p19ARF沉淀复合物，显示TAp63γ能与p19ARF相互作用。两种检测结果均暗示TAp63γ与p19ARF可能处于同一细胞信号转导通路上，作为反式作用因子行使细胞周期调控因子的功能。