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研究目的:(1)探讨新生大鼠卵巢中Foxo3a(Forkhead box group O)转录因子表达水平与卵母细胞凋亡的相关性。(2)初步检测Foxo3a参与卵母细胞凋亡调控的通路:Foxo3a调节卵母细胞的凋亡是否与Bim、FasL(Fas ligand)、p27KIP1、caspase-3和caspase-8有关。 材料与方法:(1)购买250g左右的成年健康SD大鼠,在怀孕后约19.5天生产,取新生1、2、3、4天龄雌性大鼠,每组5只,脱臼处死后,立即取出双侧卵巢,在10％甲醛中固定1-1.5h,梯度酒精脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,连续切成4μm厚的组织片。(2)对切片进行HE染色,以观察4天内大鼠卵巢卵泡发育动力学:组织切片经二甲苯脱蜡,100%,95%,80%,70%和50%梯度酒精水化,苏木素伊红染色后,二甲苯透明,中性树胶封片,显微镜观察拍照。(3)采用ABC免疫组织化学方法检测蛋白(Foxo3a、Bim、FasL、p27KIP1、caspase-3和caspase-8)表达水平并对其进行定位观察:组织切片脱腊水化,2%的小牛血清白蛋白封闭30 min;与山羊抗大鼠Foxo3a、FasL(1:25稀释),兔抗大鼠caspase-3、Bim、caspase-8(1:50稀释)及小鼠抗大鼠p27KIP1(1:50稀释)4℃孵育过夜;生物素标记的抗山羊IgG抗体(1:100稀释),抗兔IgG抗体(1:100稀释),抗小鼠IgG抗体(1:100稀释)室温孵育1 h;与ABC试剂反应30min;3,3二氨基联苯胺(DAB)显色;苏木素复染。PBS取代一抗作为空白对照。显微镜观察并拍照。(4)采用末端脱氧核苷酰基转移酶介导的dUTP切口末端标记(TUNEL)技术观察新生大鼠卵母细胞的凋亡情况。本实验按试剂盒要求操作,蛋白酶K消化15min,核固红复染,显微镜观察拍照。阳性结果判断:被染成深蓝色的为阳性细胞。(5)采用Foxo3a或Bim免疫荧光和DAPI复染检测Foxo3a或Bim阳性的卵母细胞是否有凋亡的形态学特征。卵巢组织切片脱蜡与水化,封闭液(2%小牛血清)封闭30min,山羊抗Foxo3a或兔抗Bim4℃孵育过夜,抗山羊Alexa-555标记的IgG(1:50稀释,红色)或抗兔Alexa-488标记的IgG(1:50稀释,绿色)室温孵育1h,DAPI(蓝色)复染15min,抗淬灭剂DABCO封片,荧光显微镜观察并拍照,SimplePCI软件进行图像合成与分析。(6)采用Foxo3a或Bim免疫荧光和TUENL荧光双标方法检测蛋白Foxo3a或Bim阳性的卵母细胞是否为凋亡的细胞。组织切片脱腊水化后,蛋白酶K室温反应8min,2%的小牛血清白蛋白封闭30 min;与兔抗Foxo3a或Bim抗体(1:50一起稀释)37℃孵育2h,用荧光素Cy3(红色)标记的抗兔二抗37℃孵育1h，用FITC(异硫氰酸荧光素,绿色)标记的rTdT反应混合液37℃孵育1h, DAPI(蓝色)复染15min,抗淬灭剂DABCO封片,荧光显微镜观察并拍照,SimplePCI软件进行图像合成与分析。 结果:(1)新生鼠卵巢卵泡发育动力学观察:新生大鼠4天内卵巢的卵泡分为:未装配的卵泡(卵母细胞巢内的卵母细胞)、早期原始卵泡、原始卵泡、发育卵泡.HE染色结果显示,在1d的大鼠卵巢内主要是早期原始卵泡约为76.73%,在2d到4d时主要是原始卵泡,到生后第4天原始卵泡约占70%。(2) TUENL染色结果和Foxo3a、Bim、p27KIP1、caspase-3、caspase-8、FasL免疫组织化学细胞的定位及其表达水平的观察和分析:①TUNEL染色阳性细胞主要在部分早期原始卵泡和原始卵泡的卵母细胞。1d、2d、3d、4d龄大鼠卵巢内卵母细胞TUNEL阳性率依次约为:7.24%,7.35%,4.07%,1.82%。1d与2d的TUNEL阳性率比较无统计学差异(p>0.05),其余相邻年龄组(2d与3d,3d与4d)比较均有统计学差异(p<0.05)。②具活性的Foxo3a主要在部分早期原始卵泡和原始卵泡卵母细胞的胞核内表达,1d、2d、3d、4d龄大鼠卵巢内卵母细胞活性的Foxo3a阳性率依次约为:6.71%,7.61%,3.62%,1.82%。1d与2d的Foxo3a阳性率比较无统计学差异(p>0.05),其余相邻年龄组比较均有统计学差异(p<0.05)。在1d、2d、3d、4d龄大鼠卵巢内,其对应年龄段Foxo3a阳性率与TUNEL阳性率均无统计学差异(p>0.05)。③Bim也主要在部分早期原始卵泡和原始卵泡卵母细胞的胞浆和胞核内表达,1d、2d、3d、4d龄大鼠卵巢内卵母细胞Bim阳性率依次约为:4.76%,6.47%,3.29%,1.76%。1d与2d的Bim阳性率比较无统计学差异(p>0.05),其余相邻年龄组比较均有统计学差异(p<0.05)。第1天的Bim与TUNEL的阳性率比较有统计学差异(p<0.05),其余的对应年龄段Bim与TUNEL的阳性率比较均无统计学差异(p>0.05),且在对应年龄段Bim与Foxo3a阳性率比较均无统计学差异(p>0.05)。④FasL主要在部分早期原始卵泡和原始卵泡卵母细胞的胞浆和胞核内表达,1d、2d、3d、4d龄大鼠卵巢内卵母细胞FasL阳性率依次约为:2.83%,4.28%,2.57%,0.99%。1d与2d的FasL阳性率比较无统计学差异(p>0.05),其余相邻年龄组比较均有统计学差异(p<0.05)。在第2天 FasL阳性率与 Foxo3a阳性率比较有统计学差异(p<0.05),在其余对应年龄段无统计学差异(p>0.05)。⑤p27KIP1主要在部分早期原始卵泡和原始卵泡卵母细胞的胞浆和胞核内表达,1d、2d、3d、4d龄大鼠卵巢内卵母细胞p27KIP1阳性率依次约为:4.92%,6.86%,4.20%,1.49%。对1d、2d、3d、4d龄大鼠卵巢内卵母细胞p27KIP1阳性率各相邻年龄组比较均有统计学差异(p<0.05)。在对应年龄段 p27KIP1阳性率与Foxo3a阳性率均无统计学差异(p>0.05)。⑥Caspase-8主要在部分早期原始卵泡和原始卵泡卵母细胞的胞核和胞浆内表达,1d、2d、3d、4d龄大鼠卵巢内卵母细胞caspase-8阳性率依次约为:4.84%,6.08%,3.76%,1.29%。⑦Caspase-3主要在部分早期原始卵泡和原始卵泡卵母细胞的胞核和胞浆内表达,1d、2d、3d、4d龄大鼠卵巢内卵母细胞caspa se-3阳性率依次约为:6.92%,10.05%,5.30%,1.87%。(3)蛋白Foxo3a或Bim免疫荧光和TUENL荧光双标方法检测结果显示:Foxo3a阳性的卵母细胞经DAPI染色观察有凋亡细胞的形态学特征-核凝集和核碎裂,Foxo3a阳性的卵母细胞同时也呈TUNEL阳性;Bim阳性的卵母细胞经DAPI染色观察也有凋亡细胞的形态学特征,且Bim阳性的卵母细胞同时也呈TUNEL阳性。 结论:(1)Foxo3a转录因子参与卵泡卵母细胞的凋亡调控。(2)Bim可能作为Foxo3a的下游靶分子参与卵母细胞的凋亡调控。(3)推测:FasL、p27KIP1、caspase-3及caspase-8蛋白也可能参与新生大鼠卵母细胞的凋亡调控。