研究背景细菌感染是影响伤口愈合的主要因素之一,伤口渗出液里含有的大量的炎症因子、蛋白酶和自由基都会减缓伤口的愈合速度。新型复合生物抗菌敷料的研发对治疗外科感染伤口有重要的意义,是创伤敷料发展的必然趋势。自从英国学者Winter提出,伤口在湿润的环境下比干燥的环境下要愈合得快以来,使得人们对伤口愈合的过程有了新的认识[1]。如果创面皮肤局部浸渍,会降低宿主抵御微生物侵袭的防御屏障,另一方面,在干燥条件下,细胞的活动将受到抑制,会形成痂,并进一步发生组织坏死的可能,影响伤口愈合[2-3]。对创面敷料的基本要求是：具有一定的透水透气性,较少热量和电解质的损失,减少蛋白质的丢失,加速伤口的愈合,降低疼痛的感觉,无毒性,无抗原性,有广泛的适用性,而且价格低廉[4-5]。随着医学生物工程及组织生物学的发展,目前认为理想的创面敷料还应具备以下功能：①能吸收多余的渗出物,与伤口接触面保持一定湿度；②具有良好的易成凝胶性、粘附性及生物相容性；③移去敷料时不会造成伤口二次损伤,具有良好的生物降解性；④具有一定的抗菌性；⑤防止微生物、有害微粒及其他有害物质污染伤口；⑥制作及降解过程不会造成环境污染。国内有报道称慢性伤口初期选择现代抗感染性敷料,能有效的对伤口局部抗感染和引流[6]。海藻酸盐是海洋生物资源之一,因其储量丰富、可再生及没有二次污染而被选择成为人类未来理想的生物资源。海藻酸钠具有很好的凝胶特性,已被广泛应用于工业、农业和医药等众多领域,显示出良好的发展前景[7]。藻酸钠是可溶于水的明胶样碳水化合物,在其水溶液中加入二价阳离子作用下可发生聚合反应,形成网状结构的凝胶,藻酸钠溶液与氯化钙溶液混合,形成藻酸钙,交联过程均匀,具有良好的通透性,利于大分子通过,有利于其中的种子细胞进行营养物质交换和信号传递；其制备方法温和,形成的凝胶具有多孔状结构[8]。以海藻酸盐为原料研发的海藻纤维具有无毒性、高吸水成凝胶性、高透氧性、良好的生物相容性、整体易去除性、良好的生物降解吸收性、止血性能、能促进伤口愈合、高离子吸附性等优越特性,已被广泛应用于生物医学的研究。藻酸钙在体内以酶解方式降解,在体内降解时间报道不一致,但藻酸钙具有完全降解性[9-10]。早在1951年,Blaine等就探讨了使用海藻酸作为手术中的可吸收止血材料的可能性,同时发现海藻酸对细菌生长有抑制作用[11]。藻酸生物敷料从天然海藻中提取,加工过程中使用的材料没有任何毒性,因而海藻酸纤维生物敷料对人体无毒[12]。海藻酸能够维持创面一个湿润的环境,有利于创面愈合和皮肤再生.海藻酸生物敷料止血性能良好,能很好地降低伤口的疼痛,另外其成本也比较低。银离子因其抗菌能力强、细菌耐药发生率低被选用作抗菌材料已有悠久的历史,银被认为具有广谱的抗菌活性[13],对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、真菌、部分病毒等均有抗菌作用[14],甚至对耐药菌株都显示出很强的抗菌作用[15]。研究表明银粒子不仅具有抗炎特性还有止痛作用[16-17],能抑制DNA的复制,具有很强的渗透性,能渗透到皮下组织,与切口接触后迅速持久地释放纳米银粒子,快速有效地杀灭切口及缝线上的病原体。目前大量耐药菌的发生和增长促进银再次被作为抗菌剂应用,银化合物由于其广泛杀菌活性和抗炎作用被用作创面的治疗[18]。添加银离子的海藻酸敷料表现较强的出快速杀菌能力,可用于感染伤口的局部控制细菌繁殖。目前已有国内外多家生产企业推出的纳米银医用抗菌敷料是将纳米银附着于医用脱脂纱布或医用非织造布敷料。广东省百合医疗科技有限公司研发添加纳米银海藻酸钙纤维的新型复合生物抗菌敷料,该敷料研发对防治外科伤口感染、促进慢性伤口愈合、减轻伤口的炎症反应、减少患者的不适感、缩短患者的住院时间及减轻治疗负担等有重大的意义。与此同时,添加纳米银海藻酸钙纤维的新型复合生物抗菌敷料的抗菌性能及生物毒性检测对保证其安全有效的应用极为重要。目的研制添加纳米银海藻酸钙纤维的新型复合生物抗菌敷料,并充分评价其抗菌性能、吸湿性能及其在体内外的生物相容性,为其作为优质敷料进一步应用于防治外科感染伤口、促进伤口愈合提供最佳的选择。方怯1、添加纳米银海藻酸钙纤维的新型复合生物抗菌敷料的制备。湿法纺丝制得纳米银藻酸盐纤维,再经无纺布工艺纺制成纳米银藻酸盐敷料：纳米银溶液通过搅拌、超声波均匀分散于水中,边高速搅拌边加入海藻酸钠至形成粘稠溶液,脱泡过滤后通过喷丝孔挤出到含有钙离子的凝固浴中,形成固态纳米银海藻酸钙纤维长丝。该长丝经过拉伸、水洗、脱水干燥、卷曲形成纤维；纤维可梳理成网而制成非织造布,还可经过针刺使纤维互相交缠而增加强力。2、新型复合生物抗菌敷料体外抗菌性能的研究。本研究采取贴膜法检测新型复合生物抗菌敷料对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的抗菌性能,并将新型复合生物抗菌敷料与添加银离子的海藻酸钙敷料和单纯海藻酸钙敷料的抗菌性能作比较。将标准菌株金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌传代培养,混悬于TSB培养液中,采用麦氏比浊法配置成浓度为1.5×108CFU/mL的菌液,并依次做2次10倍递增稀释。分别吸取200μL菌液接种在各组抗菌试件表面(每种敷料做五个平行标本),盖上消毒PE膜,培养24h。24h后取出培养的样品,分别加入洗脱液20mL,反复洗各组受试样品的覆盖膜(用镊子夹起薄膜冲洗),旋涡振荡1min充分摇匀后,取200μl接种于营养琼脂培养基(NA)中,在(37±1)℃下培养24h后计数菌落数CFU。以上实验重复两次,结果取平均值。3、新型复合生物抗菌敷料体外吸湿性能的研究称取8.3g的氯化钠和0.277g的无水氯化钙,溶于1L的蒸馏水中配制成英国药典规定的A溶液。在测试敷料的吸液率时,把三种敷料分别裁成5cm×5cm尺寸后放置24h,使纤维的回潮率达到平衡。这时测定敷料的初始质量为W。称取比敷料重40倍的A溶液,分别将溶液和敷料对应放置在2个直径为9cm的培养皿中,在37℃下放置30min后用镊子夹住敷料的一角在空中,挂30s后称取敷料的湿质量(W1)。单位质量敷料的吸液率=(W1-W)/W(g/g),单位面积的吸液率=4(W1-W) g/100cm2。重复上述实验3次,求其平均值。测试液体在纤维内和纤维之间的分布时,把吸液后的敷料(质量为W1)用纱布分别包扎起来放在脱水机中脱水15min后,测定脱水后敷料的质量为W2,这个质量是纤维本身的干质量和吸收进纤维内部的液体质量的总和。然后把离心脱水后的敷料在105℃干燥4h,试样至恒质量后测得纤维的干质量W3。W1-W2是吸收在纤维之间的液体,而W2-W3是吸收进纤维内部的液体。(W1-W2)/W3和(W2-W3)/W3能分别计算出每克干质量的敷料吸收到纤维之间和纤维内部的液体。4、按国家GB/T16886-2008和ISO10993.12-2009中的一系列标准要求,对制备的添加纳米银的新型复合生物抗菌敷料进行细胞毒性实验、急性全身毒性实验、溶血实验,以综合评价其生物相容性,并与添加银离子的海藻酸钙敷料和单纯海藻酸钙敷料的生物相容性作比较。细胞毒性实验：将实验组((添加纳米银的新型复合生物抗菌敷料浸提液)、阴性对照组(2%小牛血清RPMI1640)与阳性对照组((5%的二甲基亚砜)各3ml,分别置于6孔的细胞培养皿内,加入4x104/ml L-929细胞悬液3ml,在37℃、体积分数5%CO2的培养箱环境下培养72h后,观察细胞形态及生长情况。将200ul浓度为4X104/mL的L-929细胞悬液接种于3块96孔培养板中,同样的培养箱中培养24h,细胞贴壁生长,弃原液后分别加入实验组(添加纳米银的新型复合生物抗菌敷料浸提液、添加银离子的海藻酸钙敷料浸提液和单纯海藻酸钙敷料浸提液)、阴性对照组(2%小牛血清RPMI1640)与阳性对照组(5%的二甲基亚砜)各200μl,每种提取液重复4孔/板,培养箱培养72h后,观察细胞形态及生长情况。并采用MTT比色法测定L-929细胞培养72h的相对增殖率(RGR),评价材料的细胞毒性。将实验组三种浸提液分别用2%小牛血清的RPMI1640培养液按体积分数75%,50%,25%,10%,1%梯度稀释,然后分别取200μL的实验组浸提液各自的各种浓度的稀释液重复以上实验,同样采用2%小牛血清RPMI1640为阴性对照组与5%的二甲基亚砜为阳性对照组,采用MTT比色法测定L-929细胞培养72h的相对增殖率(RGR),评价材料被稀释后的细胞毒性变化。急性全身毒性实验：按50ml/kg剂量标准,无菌条件下将添加纳米银的新型复合生物抗菌敷料浸提液注入试验组小鼠腹腔内,阴性对照组注入生理盐水,阳性对照组注入苯酚。给药后连续7天观察小鼠,记录小鼠呼吸、进食、运动等一般情况、毒性反应、体重变化或死亡。溶血实验：取10ml受试样品浸提液(添加纳米银的新型复合生物抗菌敷料浸提液)、10ml生理盐水(阴性对照组)、10ml蒸馏水(阳性对照组),分别加入0.2m1的新鲜抗凝稀释兔血,肉眼观察是否出现明显的溶血现象；酶标仪检测各样本上清液的吸光度,评价受试材料的体外血液相容性。5、通过扫描电镜,观察新型复合生物抗菌敷料的微观结构将已灭菌的新型复合生物抗菌敷料与添加银离子的海藻酸钙敷料和单纯海藻酸钙敷料分别裁剪成1cmX1cm大小正方形,经高压灭菌后用戊二醛及锇酸双固定标本,以金属镀膜法把铂蒸发后覆盖在样品表面将样品标本放在扫描电镜下观察各自的显微结构,主要检测敷料在电镜下银离子和纳米银的形态及分布情况。将裁剪成1cmX1cm大小的实验样品分别放进已经滴入0.2mL浓度为1.5X106cfu/mL的金黄色葡萄球菌(ATCC29213)菌液的胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)中,然后将灭菌培养试管放置在(37±1)℃、相对湿度大于90%条件下培养24h。24h后用无菌镊子取出样品敷料,检测细菌在各敷料上的分布情况。结果1、新型复合生物抗菌敷料体外抗菌性能评价新型纳米银海藻酸钙敷料对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌抑菌率分别为99.7%和99.7%,含银离子的海藻酸钙敷料对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌抑菌率分别为97.8%和97.0%,海藻酸钙敷料对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌抑菌率分别为84.9%和84.4%。体外抗菌实验提示3种海藻酸钙敷料均金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌均有一定的抑菌能力,新型纳米银海藻酸钙敷料在抑制和杀灭金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌中有明显的优势。组间比较有明显的差异(P<0.05),新型纳米银海藻酸钙敷料对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌具有显著的抗菌效能。2、新型复合生物抗菌敷料体外吸湿性能的评价在对新型复合生物抗菌敷料、添加银离子的海藻酸钙敷料和单纯海藻酸钙敷料三种材料进行离心脱水及干燥后发现,海藻纤维本身具有良好的吸水性,所吸收的水分中一大部分能被保留在纤维内部,很难通过离心脱水去除,添加了银离子或纳米银的海藻酸钙敷料并没有影响敷料的吸湿率。3、新型复合生物抗菌敷料的生物相容性评价细胞毒性实验：新型复合生物抗菌敷料和单纯海藻酸钙敷料浸提液的细胞贴壁生长,折光性较强,细胞呈现梭形,没有出现细胞脱落、裂解等细胞病变情况,72h后RGR分别为90.5%,95.7%,两组细胞毒性反应均为Ⅰ级；添加银离子的海藻酸钙敷料浸提液作用小鼠成纤维细胞72h后RGR为36.1%,细胞毒性反应均为Ⅲ级。提示海藻酸钙敷料及添加纳米银的新型复合生物抗菌敷料都具有良好的细胞相容性,无细胞毒性；添加银离子的海藻酸钙敷料具有一定的细胞毒性,并提示而只有当含银离子海藻酸钙敷料浸提液稀释到原溶液的四分之一时,72h后RGR为78.1%,才显示出较低的细胞毒性。急性全身毒性实验：实验组的小鼠在注射浸提液后,进食、呼吸、活动、排泄均未发现异常,在七天的观察期里,小鼠体重呈增加的趋势,未发现惊厥、步态不稳、狂躁等毒性反应,也没有出现死亡病例。溶血实验：受试材料的浸提液没有引起体外溶血反应,新型复合生物抗菌敷料的溶血率分别为1.41%。4、通过扫描电镜,观察新型复合生物抗菌敷料的微观结构新型纳米银海藻酸钙敷料内的纳米银粒子呈较规则球形,平均粒径较小,均匀地分布在海藻酸纤维之间的孔隙中。银离子海藻酸钙敷料的微观结构,银粒子颗粒大,平均粒径可达1μm,且形状及分布不如纳米银形状规则。新型复合生物抗菌敷料中仅有少量细菌零星地分布在纤维上；添加银离子的海藻酸钙敷料有少量细菌分布在纤维上,部分细菌落形成条索状分布,但在纤维间并没有形成链接的细菌条索；单纯海藻酸钙敷料可以看到一层薄薄的细菌生物膜分布在纤维上,而且在纤维之间形成细菌膜的连接。结论1、本课题用湿法纺丝制得纳米银藻酸盐纤维,再经无纺布工艺纺制成新型复合生物抗菌敷料。并通过体内外实验证实该新型敷料具备较强的抗菌性能、高吸湿凝胶性和优异的生物相容性。2、根据QB/T2591-2003规定材料对微生物的抑菌率>90%才能被称为抗菌材料,通过平板计数实验证实该新型复合生物敷料表现出较强的抗菌性能,而且通过扫描电镜观察,该新型复合生物抗菌敷料的纳米银离子在海藻酸钙纤维上分布均匀,抗菌性能比海藻酸钙纤维及添加银离子的海藻酸钙纤维强。3、海藻酸纤维具有良好的吸湿能力,在往海藻酸钙纤维中添加纳米银制成新型复合生物抗菌敷料后,并没有影响海藻酸钙纤维的吸湿能力,实验证实该新型复合生物敷料具备较强的吸湿能力,与海藻酸钙纤维相当(P>0.05)。4、据GB/T16886-2008及IS010993-2009的系列标准对于生物材料生物相容性的要求及检测方法,实验结果较充分地表明本课题组制备的新型复合生物抗菌敷料无细胞毒性、无全身急性毒性,也不引起溶血反应,与海藻酸钙纤维比较,生物相容性无明显差异。该新型复合生物抗菌敷料具有良好生物相容性,为进一步作为抗菌敷料应用于临床提供了有力的实验依据。