论文部分内容阅读
产肠毒素性大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEc)是引起幼畜腹泻的主要病原之一，该菌的致病性与其具有黏附素和产肠毒素密切相关。迄今，在幼畜的ETEC中发现的黏附素抗原有K<,88>、K<,99>、987P、F<,41>、F<,42>、。F<,165>、F<,17>、F<,18>等，而以K<,88>、K<,99>、987P、F<,41>最为流行。黏附素是一种具有良好免疫原性的蛋白质抗原，用带有黏附素的菌体或纯化的黏附素抗原免疫动物均可以产生高效价的相应抗体。
本研究应用PCR方法从产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)中扩增出不含信号肽序列的K<,99>菌毛蛋白基因(476bp)，将此基因片段克隆到原核表达载体pET-32a上，经过酶切、PCR及DNA序列分析，筛选出重组质粒DNApET-32a-K<,99>，并在大肠杆菌BL21中获得高效表达。鉴定表达的重组K<,99>融合蛋白(34kDa)经镍柱分离纯化，获得了高纯度的纯化蛋白质，用纯化的蛋白质免疫SPF新西兰大白兔，获得的抗血清可以标准的强毒株C<,83912>和免疫原发生特异性的抗原抗体反应，证明了重组蛋白质具有良好的免疫原性。
为了证明原核表达的K<,99>菌毛作为抗原的免疫保护性，此后，我们将K<,99>重组蛋白制成亚单位疫苗对动物的保护性作了初步的研究，以皮下多点注射免疫SPF级昆明系雄性/雌性小鼠，免疫后小鼠产生了特异性K<,99>菌毛蛋白的抗体，并在三免后达到较高水平。用致死剂量的标准菌株C<,83912>进行小鼠攻毒，免疫组小鼠的60-70％可以抵抗致死强毒的攻击，而对照组小鼠先后发病且全部死亡。纯化的K<,99>菌毛蛋白显示了较好的免疫保护效果。本研究为产肠毒素大肠杆菌(ETEC)病检测方法的建立、预防及基因工程疫苗的进一步研究奠定了基础。