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背景和目的盘状结构域受体（DDRs）是在研究表达于人类恶性肿瘤的酪氨酸激酶蛋白时发现的一种新的受体酪氨酸激酶（RTK）亚家族,其主要作用是感受微环境中胶原量和构型的变化,然后以粘附、迁移、分化、生存、增殖的方式调节细胞反应。在哺乳动物中包括DDR1和DDR2两类。研究显示,DDR2在肝纤维化等病理过程中发挥重要作用。我们前期研究的动物实验表明,在酒精性肝纤维化大鼠模型中,随酒精灌胃进行与肝纤维化程度进展,DDR2表达呈时间依赖性增加,且DDR2与肝组织内Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原及血清透明质酸、Ⅳ型胶原等均呈正相关,并且在经治疗肝纤维化减轻的大鼠中,出现DDR2表达下调,表明DDR2表达与和纤维化程度相关。本实验进一步分析了盘状结构域受体2（DDR2）和基质金属蛋白酶2（MMP2）表达在大鼠酒精性肝纤维化发生中的作用。在以上研究的基础上,设计并构建大鼠DDR2基因的RNA干扰慢病毒载体,包装病毒颗粒并筛选有效的RNA干扰病毒。为进一步研究DDR2的作用机制与肝纤维化等相关疾病的临床治疗提供RNA干扰工具。方法1、免疫组化检测DDR2与MMP2在酒精性肝纤维化大鼠中的表达成年雄性Wistar大鼠共16只,正常饲养1周后随机分为2组:正常对照组（N组）与模型组（M组）。其中模型组10只,在橄榄油拌平衡饲料喂养大鼠的基础上,给予每日两次白酒、吡唑混合液胃内灌注,白酒折算成酒精后其量及浓度每两周递增一次,吡唑按25mg/kg·d溶于灌胃酒精中。正常对照组（6只）给予等量生理盐水每日两次灌胃。模型组与正常对照组均于16周全部处死。取肝组织标本,通过HE染色、Masson染色观察肝脏病理学改变,采用免疫组化染色方法观察DDR2与MMP2在肝组织中的表达。2、DDR2基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定（1）大鼠DDR2基因RNAi慢病毒载体的制备根据在Genebank中检索的大鼠DDR2基因序列,设计3对针对大鼠DDR2基因的siRNA（small interference RNA,siRNA）序列siRNA1、siRNA2、siRNA3,设计合成含有相应的短发夹RNA序列并具有AgeⅠ和EcoRⅠ酶切粘性末端干扰序列的双链DNA oligo:pGCSIL-GFP慢病毒载体经AgeⅠ和EcoRⅠ双酶切后与双链DNA连接重组,转入用氯化钙制备新鲜的大肠杆菌感受态细胞,进行阳性克隆筛选、PCR和测序鉴定,获得相应vshRNA慢病毒重组载体DDR2/LV-shRNA。（2）重组vshRNA慢病毒颗粒的包装与滴度测定将DDR2/LV-shRNA、pHelper 1.0和pHelper 2.0三质粒共转染293T细胞,包装扩增出相应的重组vshRNA慢病毒颗粒DDR2/Lenti-shRNA1、DDR2/Lenti-shRNA2、DDR2/Lenti-shRNA3,倍比稀释法在293T细胞中测定病毒的滴度。（3）有效DDR2 vshRNA慢病毒的筛选用DDR2 vshRNA慢病毒感染体外培养NRK52E细胞。72小时后在荧光显微镜下观察,根据细胞内绿色荧光蛋白（GFP）的表达情况分析感染效率;5天后收集细胞实时荧光定量PCR法检测DDR2 mRNA的表达水平。2-ΔΔCt法计算并比较各组病毒在细胞中对DDR2表达的基因沉默效应,筛选有效的DDR2 RNA干扰靶点。结果1、酒精灌胃造模16周后,模型组大鼠肝组织病理检查呈典型的轻度肝纤维化表现,肝组织内胶原纤维较正常对照组显著增多（P＜0.01）。免疫组化检测显示,模型组DDR2、MMP2表达较正常对照组均有显著性增加（P＜0.01）,且DDR2在肝组织内的分布与胶原纤维分布相一致。2、对重组阳性克隆的PCR鉴定显示,连接入vshRNA片段的阳性克隆PCR片段大小为343bp（从载体中切掉24bp）,没有连接入vshRNA片段的空载体克隆PCR片段大小为306bp,鉴定结果和预期一致。测序结果表明合成的各组DDR2 vshRNA核苷酸序列均插入正确。采用慢病毒载体系统在293T细胞中包装获得3组重组慢病毒,病毒滴度达到2×108TU/mL。分别感染NRK52E细胞后,荧光显微镜下观察各重组慢病毒的感染效率均达到80%。RT-PCR检测分析显示,DDR2/Lenti-shRNA1和DDR2/Lenti-shRNA3对NRK52E细胞DDR2 mRNA表达的抑制效率达到80%以上。结论1、通过给予橄榄油拌平衡饲料喂养及白酒、吡唑混合液灌胃可以成功建立酒精性肝纤维化大鼠模型。DDR2可能通过MMP2介导胶原与肝星状细胞间的相互作用,参与酒精性肝纤维化的发生发展。2、成功构建了3组DDR2基因RNA干扰慢病毒载体。RNA干扰慢病毒载体经293T细胞包装后,可获得高滴度的重组慢病毒。在NRK52E细胞中筛选出DDR2/Lenti-shRNA1和DDR2/Lenti-shRNA3可高效特异性抑制DDR2基因表达,为有效靶点病毒。