新农药创制主要有两条途径：一是分子结构创新，即计算机辅助分子设计、化学或生物合成以及从天然产物中发现新的先导化合物；二是农药作用靶标创新，即综合运用生物信息学、分子生物学和药理学等方法寻找农药作用新靶标和新作用机制，从而指导新先导结构的发现。要发现一种新的作用靶标，首先要对其进行组织水平和细胞水平的定位，而免疫电镜技术则是目前许多结构复杂的活性天然产物在生物体内定位的主要手段。苦皮藤素V是一种分离自杀虫植物苦皮藤（Celastrus angulatus Max．）的天然产物。研究发现它是一种新型的昆虫消化毒剂，作用于敏感昆虫的中肠上皮细胞。为了明确其作用机理，本研究首先合成了苦皮藤素V的人工抗原，通过免疫小鼠和细胞融合技术获得了苦皮藤素V的单克隆抗体，采用免疫电镜技术对其在粘虫中肠上皮细胞内的分布进行了定位研究；同时，为了为受体蛋白的分离和结构解析奠定基础还构建了东方粘虫中肠组织的cDNA表达文库。研究结果如下：1．将苦皮藤素V与琥珀酸酐反应合成了苦皮藤素V的半抗原，经¹H和¹³C核磁共振、红外光谱和高分辨质谱分析，该化合物结构为苦皮藤素V-单琥珀酸酯（简称半抗原，hapten），该反应在苦皮藤素V骨架上成功引入了一个羧基。采用碳二亚胺法将半抗原分别与牛血清白蛋白（BSA）、钥孔蓝蛋白（KLH）和鸡卵清蛋白（OVA）进行偶合，制备了3种苦皮藤素V的人工抗原：hapten-BSA、hapten-KLH和hapten-OVA。经紫外（200～400nm）和红外(400～4000cm^-1)扫描，确证苦皮藤素V的半抗原与3种载体蛋白偶联成功。2．以苦皮藤素V的人工抗原hapten-KLH作为免疫抗原注射小鼠，取免疫脾细胞与SP2／0细胞融合，经过克隆化和以hapten-BSA、hapten-OVA为ELISA包被抗原的筛选，首次获得了3株可产生苦皮藤素V特异性抗体的杂交瘤细胞系：C₆-E₉-B₁₁、C₆-E₉-C₅和C₆-E₉-H₃。将3株杂交瘤细胞系进行了扩大培养，注射小鼠腹腔后获得了含高浓度苦皮藤素V单克隆抗体的腹水，经ELISA检测其抗体滴度均可达7．5×10⁴，可以满足检测要求。3．对苦皮藤素V中毒东方粘虫的中肠上皮细胞进行了超微结构观察，发现苦皮藤素V可以引起柱状和杯状上皮细胞的微绒毛、线粒体、粗面内质网和细胞核的严重病变：微绒毛断裂，倒伏，畸形分叉，脱落；线粒体内外膜分离出现空腔，脊不明显；粗面内质网结构紊乱，粗缩，出现严重空泡化；细胞核凋亡，核仁与染色质浓缩,电子密度增加。透射电镜观察还发现苦皮藤素V处理后，东方粘虫中肠上皮细胞膜内外泡状物增多，并以出芽的方式从细胞内向细胞外分泌。初步推测这种病理现象可能与昆虫中毒后的失水机制有关。4．制作了苦皮藤素V处理后不同时期东方粘虫中肠的组织超薄切片，分别以苦皮藤素V单克隆抗体和胶体金标记的羊抗小鼠免疫球蛋白为第一、第二抗体，采用免疫电镜技术对苦皮藤素V在粘虫中肠上皮细胞内的分布进行了细胞定位，结果表明：苦皮藤素V在柱状和杯状细胞的微绒毛、线粒体和粗面内质网上均有分布；而且随着处理时间的延长，苦皮藤素V的结合量呈动态增加趋势，其对上皮细胞的损伤程度也更加严重。由此，首次证实苦皮藤素V是一种作用于昆虫中肠上皮细胞的消化毒剂，在敏感昆虫中肠上皮细胞内存在苦皮藤素V的特异性结合受体。5．以粘虫中肠组织为生物材料，通过Trizol法和oligo（dT）纤维素柱分离技术依次获得了粘虫中肠的总RNA和mRNA，采用SMART技术首次成功构建了粘虫中肠的λTriplEX噬菌体表达文库。初始文库滴度为1．07×10⁷，重组率为95．8％，完全符合cDNA文库的指标。然后分别以苦皮藤素V、苦皮藤素V单克隆抗体和辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠免疫球蛋白为探针和第一、第二抗体，采用Druge-western和ECL显色技术，对东方粘虫中肠的cDNA文库进行了筛选。结果表明：在粘虫中肠的λTriplEX噬菌体表达文库中没有发现苦皮藤素V的受体蛋白基因。推测苦皮藤素V的受体蛋白可能是由一种多亚基组成的同源或异源多聚体，甚至可能与细胞膜存在关联。因此，采用常规筛选cDNA文库的方法还无法做到对受体基因的克隆和表达。