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单增李斯特菌（Listeria monocytogenes,Lm）是革兰阳性食源性病原菌,导致病死率高达20-30%的人兽共患病-李斯特菌病（listeriosis）。Lm的环境适应性极强,尤其是能在低温下生长繁殖。当前,低温是保藏食品的最主要方式,Lm能在冷藏温度下生长,这无疑给食品安全带来极大的风险,而且冷藏时间越长食品安全风险越高,因此控制Lm低温生长意义重大。探究Lm低温生长机制将为控制Lm低温生长措施的制定和低温生长抑制剂的研发提供理论依据。双组分信号转导系统（two-component signal transduction systems,TCSs）是细菌感应外界信号调控基因表达以适应环境而生存的重要调控系统,由感应信号的组氨酸激酶（histidine kinase,HK）和具有转录因子功能的应答调控子（response regulator,RR）组成。本课题组分析总结了Lm食品分离株LM201的TCSs,发现LM201有14对TCSs（HK/RR）和两个孤儿RR,本课题组发现其中一对TCS即LisK/R的HK的缺失（ΔlisK,对应的缺失株命名为S0192）导致Lm低温4℃生长速率显著下降,本研究就此现象背后的机制进行了初步探究。本研究构建了LisK/R的RR缺失株S2001（ΔlisR）以及LisK/R缺失株的回补株S0192c（ΔlisKc）和S2001c（ΔlisRc）;测定了缺失株和互补株的低温（4℃）和适温（37℃）生长曲线;对缺失株S0192（ΔlisK）和亲本株LM201低温4℃生长菌体进行了RNA-Seq;分析RNA-Seq数据,发现S0192（ΔlisK）鞭毛基因表达均显著上调;随之,对LisK/R的缺失株和回补株进行了低温4℃下的运动性测定试验、透射电镜菌体鞭毛观测和RT-qPCR测定。结果表明,LisK/R是通过调控鞭毛基因的表达影响Lm低温生长。结果简述如下:1.缺失株S2001（ΔlisR）和回补株S0192c（ΔlisKc）及S2001c（ΔlisRc）的构建以LM201为亲本株,扩增lisR上下游同源臂,用自杀温敏质粒p HT304-ts连接同源臂,获得重组自杀质粒p1001,将其导入LM201,通过同源交换完成lisR无痕缺失,获得lisR缺失株S2001。分别扩增基因lisK与lisR,分别与表达质粒p HT304连接,获得重组质粒plisKc与plisRc,分别将其电转入对应的缺失株,获得回补株S0192c（ΔlisKc）与S2001c（ΔlisRc）。2.LisK/R缺失株和回补株生长曲线测定用培养基BHI在4℃和37℃下分别培养S0192（ΔlisK）、S2001（ΔlisR）、S0192c（ΔlisKc）、S2001c（ΔlisRc）和LM201,通过测定OD600值绘制生长曲线。结果显示,在4℃条件下,缺失株S0192和S2001在对数生长期及稳定期,细菌生长速率显著低于亲本株LM201,回补株S0192c和S2001c的生长情况与亲本株的一致;缺失株、缺失回补株与亲本株在37℃下生长表型未见显著差异。结果表明双组分系统LisK/R对Lm的低温生长有影响。3.缺失株S0192（ΔlisK）和亲本株LM201低温4℃生长转录组测序分析对4℃条件下生长的缺失株S0192（ΔlisK）和亲本株LM201菌体进行转录组测序（RNA-Seq）。分析测序结果发现,与亲本株LM201相比,缺失株S0192鞭毛运动基因表达均显著上调,这暗示低温4℃下双组分系统LisK/R对鞭毛基因表达有调控作用。4.LisK/R缺失株和回补株低温4℃下运动性、鞭毛生长和鞭毛基因表达量的测定为了验证低温4℃下LisK/R对鞭毛基因表达有调控作用这一转录组测序结果分析的推测,本研究做了下面三个实验。（1）菌体运动性测定将S0192（ΔlisK）、S2001（ΔlisR）、S0192c（ΔlisKc）、S2001c（ΔlisRc）和LM201接种于低琼脂含量（0.25%）BHI平板,分别置于4℃4d和37℃48h,测量接种点生长直径的大小,以判断其运动性。结果显示,4℃条件下,缺失株S0192和S2001的接种点生长直径显著大于亲本株LM201（P＜0.01）,即其运动性显著强于亲本株,回补株S0192c和S2001c的运动性与LM201的一致;37℃下,缺失株、回补株与LM201相互间无显著差异。结果表明,低温4℃时LisK/R缺失株运动性显著强于亲本株LM201。（2）透射电镜（TEM）观察菌体鞭毛分别取4℃和37℃下培养至对数期的S0192（ΔlisK）、S2001（ΔlisR）、S0192c（ΔlisKc）、S2001c（ΔlisRc）和LM201菌体样品,对样品进行负染,制备铜网,TEM下观察菌体鞭毛。镜检结果显示缺失株S0192和S2001周身存在鞭毛,其鞭毛量远多于亲本株LM201,回补株S0192c未见鞭毛,回补株S2001c菌体周围仅存少量鞭毛;37℃条件下,缺失株、回补株和亲本株菌体均未见有鞭毛生长。结果表明,低温4℃时LisK/R缺失株鞭毛生长量显著多于亲本株LM201。（3）RT-qPCR测定鞭毛基因转录本表达量分别取4℃下培养至对数期的S0192（ΔlisK）、S2001（ΔlisR）、S0192c（ΔlisKc）、S2001c（ΔlisRc）和LM201菌体,提取菌体RNA,对鞭毛基因做反转录定量PCR（RT-qPCR）测定。结果显示,与亲本株LM201相比,缺失株S0192和S2001的鞭毛基因flg B、flg D、fli M、fli R、mot A和mot B表达显著上调（P＜0.05）;回补株S0192c和S2001c的这几个鞭毛基因的表达与对应的缺失株相比是显著下调的。结果表明,低温4℃时LisK/R缺失株鞭毛基因转录本表达量显著高于亲本株LM201。以上三个实验结果与转录组测序结果相呼应。鞭毛基因的表达及其组装是非常消耗能的,降低鞭毛基因的表达是单增李斯特菌在严酷环境下采取的一个能量节约策略。本研究结果表明,低温4℃时,LisK/R下调或抑制鞭毛基因的表达,菌体鞭毛生成量减少,所节省的能量被用于菌体生长繁殖,LisK/R缺失后,这种调控作用丧失,菌体产生大量鞭毛,用于生长繁殖的能量减少,缺失株生长繁殖显著缓慢。因此,LisK/R通过调控鞭毛基因的表达来影响单增李斯特菌在低温条件下的生长繁殖。