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自Wolf和Quimby在1962年建立第一个永生细胞系,即虹鳟鱼(Onchorynchus mykiss)性腺细胞系RTG-2,随后越来越多的鱼类细胞系被陆续建立。截止到2011年,全世界报道的鱼类细胞系已有275株,但性腺来源的体细胞系和肌肉来源细胞系十分稀少。鱼类性腺体细胞主要包括卵巢的间质细胞、颗粒细胞和鞘膜细胞,以及精巢的Sertoli细胞、Leydig细胞等。性腺体细胞系对于生殖细胞正常的分裂、分化和性腺组织的结构组成等方面具有决定性的作用,尤其是近几年对于生殖干细胞研究的热潮,使得性腺体细胞的体外培养成为发展必然。肌肉是鱼类主要的食用组织,而肌肉细胞系的建立则为进一步研究鱼类肌肉的生长、分化和发育提供了平台,也有助于养殖鱼类快速生长发育机制的研究和应用。鱼类细胞系已广泛应用于病毒学、遗传学、基因调控和功能分析、生理学、内分泌学、资源保护等领域。因此,开展鱼类细胞培养及细胞系建立的研究具有深远意义。鱼类性别决定和性腺分化机制研究一直是热点,而相关的表观遗传修饰-DNA甲基化对其调控作用研究还处于起步阶段。无论在海水鱼还是淡水鱼中,对于DNA甲基转移酶基因dnmt3的研究十分匮乏,环境因子如温度、外源激素等对于甲基化模式的影响更是知之甚少。而dmrt1基因被认为是迄今唯一保守的性别相关基因,近年来其在各种鱼类雌雄个体差异表达谱研究较多,但其甲基化表观遗传修饰在性腺分化中的研究报道还很薄弱。褐牙鲆(Paralichthys olivaceus),是名贵的海产养殖品种,在相同养殖成本下,雌性个体比雄性个体生长快、体积大,因而其性别决定和分化是国内外研究的热点。然而由于缺少合适的性腺细胞系,其性别相关形成机制尤其是细胞水平的机理几乎还是空白。且研究证明褐牙鲆三倍体生长明显快于二倍体,2010年已成功实现褐牙鲆三倍体诱导并达到批量化,然而到目前为止,还没有关于褐牙鲆三倍体肌肉生长发育机制的任何研究进展,更没有褐牙鲆三倍体肌卫星细胞体外培养的任何研究报道。本研究首先建立、鉴定了褐牙鲆精巢、卵巢、三倍体褐牙鲆肌肉3个细胞系,并分别对其进行外源质粒转染,以期将这3种细胞系作为体外遗传操作模型运用于外源基因载体的应用研究。同时,克隆得到褐牙鲆甲基转移酶基因dnmt3a和dnmt3b的cDNA全长。利用雌核发育褐牙鲆幼鱼为材料,通过28oC、雌二醇处理,获得遗传雌性(XX)表型雄性或雌性的褐牙鲆。之后检测了dnmt3a和dnmt3b保守区域与dmrt1在雌二醇刺激和性逆转褐牙鲆的表达关联,以期探讨甲基化作用对雄性相关基因dmrt1的调控作用。具体内容及研究结果如下:褐牙鲆精巢细胞系、卵巢细胞系,分别命名为POSC和POOC,目前分别传代到55代和34代。两细胞系都用DMEM/F12基本培养基,FBS添加量为20%,对于EGF生长因子POSC添加15 ng/ml,POOC添加20 ng/ml。POSC和POOC主要细胞类型均为成纤维样;线粒体707bp COI序列分析结果与NCBI褐牙鲆COI序列一致性为99%,证明2种细胞系均来自于褐牙鲆;染色体分析显示POSC和POOC染色体众数都为48,都具有褐牙鲆正常二倍体核型;精巢支持细胞特异抗体Fas-L免疫组化实验证明POSC主要为精巢支持细胞,POOC对卵巢间质特异抗体P450SCC和3β-HSD反应呈现阳性,证明POOC为卵巢间质细胞;脂质体2000分别成功将pEGFP-N3转染到POSC和POOC细胞系,转染效率分别为10%和15%,说明2种细胞系均适宜作为有效的外源基因转化载体,都有望应用于体外遗传操作。三倍体褐牙鲆骨骼肌肌肉细胞系命名为POMSCS(3n),经过一年的时间目前已传代66代。POMSCS(3n)适宜的生长培养基为MEM,添加20%FBS。其细胞类型主要为梭形或纺锤体样;染色体分析显示POMSCS(3n)的染色体众数为72,具有褐牙鲆正常三倍体核型;肌卫星特异标记基因pax7b RT-PCR扩增和Desmin特异抗体免疫组化实验均证明POMSCS(3n)为骨骼肌肌卫星细胞;通过利用含2%马血清的分化培养基DM诱导POMSCS(3n)细胞分化,再利用DAPI染核发现,分化组(DM培养基)相对于对照组(GM培养基)含有较多的2核甚至3-4核的多核纤维样细胞,证实POMSCS(3n)细胞具有分化潜能,且分化能力强;同样脂质体2000成功将pEGFP-N3转染到该细胞系,转染效率高达20%,说明该细胞系适宜成为有效的外源基因载体,有望成为遗传操作的有利工具。克隆获得褐牙鲆dnmt3a和dnmt3b基因cDNA全长,分别得到dnmt3a基因4个转录本,dnmt3b基因3个转录本,转录本之间相似性较高,都具有甲基转移酶保守结构域PWWP。以雌核发育褐牙鲆幼鱼为材料,通过雌二醇(E2)和高温28oC处理分别得到100%遗传雌表型雌褐牙鲆和100%遗传雌表型雄性逆转褐牙鲆,与预期结果一致。分析E2处理和28oC处理条件下,dmrt1与dnmt3a和dnmt3b表达模式,发现dmrt1与dnmt3a和dnmt3b表达有关联,且dnmt3a与dmrt1关系更为密切,暗示雄性相关基因dmrt1基因表达受甲基转移酶影响,进一步推测褐牙鲆性别决定和分化过程受甲基化作用调控。