背景动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是一种原因尚不完全清楚的慢性血管病变,以血管壁上脂质沉积、纤维斑块、粥样斑块形成,严重时斑块破裂、血栓形成为其主要特征。动脉斑块可导致血管狭窄甚至完全堵塞,最终导致相应脏器缺血乃至梗死为标志。目前其病因及发病机制尚未完全阐明,临床治疗缺乏明确有效的作用靶点,这也给AS的治疗带来极大的困难。中医学古书记载中虽无直接与AS对应的病名,但据其临床症状,可表现为中医的头晕、头痛、胸痹、中风等。目前中医对AS的病因病机认识相对集中,认为AS的基本病机是本虚标实,痰瘀互结。丹蒌片(Dan Lou Tablet, DLT)是在痰瘀同治理论指导下的代表药物,以逐瘀豁痰、益气通痹为法组方。前期研究发现,活血化痰中药DLT具有良好的抗AS疗效,但其作用机制尚未阐明。巨噬泡沫细胞形成在AS发生、发展及转归过程中发挥着关键性的作用。目前尚无针对DLT与巨噬细胞泡沫化的关系开展对抗AS的作用研究,为进一步探讨DLT对AS的干预作用,本实验依托国家自然科学基金青年项目(No.81202782)进行设计。目的通过本研究,希望能够明确DLT对AS巨噬细胞泡沫化影响的确切作用,重点探讨巨噬细胞清道夫受体CD36、血凝集素样氧化低密度脂蛋白受体1 (Lectin like oxidized low density lipoprotein receptor 1, LOX-1)与三磷酸腺苷结合盒转运体Al (ATP binding cassette transporter Al, ABCA1)在AS巨噬细胞泡沫化中的作用机制和丹蒌片对AS巨噬细胞泡沫化和炎症的作用机理,为其临床应用提供理论依据。方法1.丹蒌片对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化模型形成的影响实验分组：空白对照组(Control)、模型组(Model)、丹蒌片低剂量组(DLT-L)、丹蒌片中剂量组(DLT-M)、丹蒌片高剂量组(DLT-H)、阿托伐他汀组(LPT)。以正常饮食的ApoE-/-小鼠作为空白对照,以阿托伐他汀组(LPT)作为阳性对照。每组样本量均为10只。处理方法：应用经典的AS模型——单纯高脂饲料长周期喂养诱导AS小鼠模型,选取8周龄雄性ApoE-/-小鼠,高脂饲料喂养16周,各干预组在开始高脂饲料喂养时即给予相应的处理。DLT-L、DLT-M、DLT-H三组按照动物与人体间的等效剂量换算公式将DLT换算成小鼠剂量,分别给予DLT超微粉溶液1、2、4g/kg/d; LPT日性对照组参照文献给予2mg/kg/d; Control、Model组给予生理盐水2ml/kg/d。每天灌胃1次,连续16周。观测指标：小鼠一般情况观察,如体毛、活动、饮食、排泄等,体重变化,小动物超声评价小鼠颈动脉斑块形成情况；全自动生化分析仪检测小鼠血清血脂情况；HE染色法观察小鼠主动脉和颈动脉的病理学改变情况；免疫组化法观察血管组织特别是形成的斑块中巨噬细胞浸润情况。数据分析：数据采用SPSS 17.0进行统计分析,以均数±标准差表示,采用重复测量资料的方差分析和one-way ANOVA进行统计分析,组间两两比较方差齐性时选用LSD检验,方差不齐时选用Tamhane T2法,P<0.05为差异有统计学意义。2.丹蒌片对巨噬细胞泡沫化的影响实验分组：(1)THP-1源性巨噬细胞,分为模型组(Model),丹蒌片低剂量组(DLT20),丹蒌片中剂量组(DLT1000),丹蒌片高剂量组(DLT2000), DLT干预单位为μg/ml;(2)RAW264.7巨噬细胞,分为空白对照组(Control),模型组(Model),丹蒌片各剂量组(DLT20、DLT100、DLT500、DLT1000、DLT1500、DLT1750、DLT2000、 DLT2250、DLT2500), DLT干预单位为gg/ml。处理方法：(1)利用佛波酯(PMA)刺激THP-1细胞贴壁形成巨噬细胞,再加氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein, oxLDL) 50μg/ml刺激构建巨噬细胞源性泡沫细胞模型。Model组不加药物干预,DLT干预组加相应的DLT超微粉溶液,使其终浓度为DLT20, DLT1000, DLT2000; ox-LDL和DLT是同时加入细胞培养孔内,孵育培养24h。(2) RAW264.7巨噬细胞,Control组即不加oxLDL也不加DLT干预,余组均加oxLDL或红色荧光DiI标记的氧化低密度脂蛋白(Dil-oxidized low density lipoprotein, Dil-oxLDL)刺激,Model组不加DLT干预,DLT各干预组加相应的DLT超微粉溶液,使其总浓度为DLT20、DLT100、DLT500、DLT1000、DLT1500、 DLT1750、DLT2000、DLT2250、DLT2500, ox-LDL或DiI-oxLDL和DLT是同时加入细胞培养孔内,加ox-LDL时孵育培养24h, 加DiI-oxLDL分别孵育2h、4h、6h和24h。观测指标：利用MTT法分析OD值,评价DLT对RAW264.7细胞的毒性抑制作用；利用细胞生长记录仪记录不同浓度的DLT超微粉溶液干预下泡沫细胞的细胞生长指数；油红0染色法观察THP-1源性巨噬细胞各组细胞内红色脂滴形成情况,定性评价DLT抑制巨噬细胞泡沫化的作用；利用流式细胞分析仪分析用Dil-oxLDL刺激的RAW264.7细胞内的平均荧光强度(Mean fluorescent intensity, MFI),定量评价DLT抑制巨噬细胞泡沫化的作用；RT-PCR法检测DLT对CD36、LOX-1和ABCA1的mRNA表达水平的影响。数据分析：数据采用SPSS17.0进行统计分析,以均数±标准差表示,采用重复测量资料的方差分析和one-way ANOVA进行统计分析,组间两两比较方差齐性时选用LSD检验,方差不齐时选用Tamhane T2法,P<0.05为差异有统计学意义。3.丹蒌片对小鼠AS炎症的影响实验分组：空白对照组(Control)、模型组(Model)、丹蒌片低剂量组(DLT-L)、丹蒌片中剂量组(DLT-M)、丹蒌片高剂量组(DLT-H)、阿托伐他汀组(LPT)。以正常饮食的ApoE-/-小鼠作为空白对照,以阿托伐他汀组(LPT)作为阳性对照。每组样本处理方法：应用经典的AS模型——单纯高脂饲料长周期喂养诱导AS小鼠模型,选取8周龄雄性ApoE-/-小鼠,高脂饲料喂养16周,各干预组在开始高脂饲料喂养时即给予相应的处理。DLT-L、DLT-M、DLT-H三组按照人每天临床剂量换算成小鼠剂量,分别给予DLT超微粉溶液1、2、4g/kg/d; LPT阳性对照组参照文献给予2mg/kg/d; Control Model组给予生理盐水2ml/kg/d。每天灌胃1次,连续16周。观测指标：流式细胞分析术观察DLT对ApoE-/-小鼠AS模型脾细胞悬液中Thl-IFN丫的百分比含量的影响；RT-PCR法检测主动脉血管组织炎症因子肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α, TNF-α)和干扰素-γ(Interferon-γ, IFN-γ)的mRNA表达水平；蛋白芯片法检测小鼠血清中炎症因子TNF-α和IFN-γ的蛋白信号表达情况。数据分析：数据采用SPSS17.0进行统计分析,以均数±标准差表示,采用重复测量资料的方差分析和one-way ANOVA进行统计分析,组间两两比较方差齐性时选用LSD检验,方差不齐时选用Tamhane T2法,P<0.05为差异有统计学意义。4.丹蒌片对巨噬细胞泡沫化炎症的影响实验分组：RAW264.7巨噬细胞,分为空白对照组(Control),模型组(Model),丹萎片组(DLT20、DLT2000),DLT干预单位为μg/ml。处理方法：Control组即不加oxLDL也不加DLT干预,余组均加oxLDL, Model组不加DLT干预,DLT各干预组加相应的DLT超微粉溶液,使其总浓度为DLT20、DLT2000, ox-LDL和DLT是同时加入细胞培养孔内,孵育培养24h。观测指标：蛋白芯片法检测巨噬细胞炎症因子TNF-α和IFN-γ的蛋白信号表达情况；RT-PCR法检测巨噬细胞分泌的炎症因子TNF-α和IFN-γ的mRNA表达水平。数据分析：数据采用SPSS17.0进行统计分析,以均数±标准差表示,采用重复测量资料的方差分析和one-way ANOVA进行统计分析,组间两两比较方差齐性时选用LSD检验,方差不齐时选用Tamhane T2法,P<0.05为差异有统计学意义。结果1.丹蒌片对ApoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化模型形成的影响小鼠一般情况、体重变化情况：各组小鼠精神、毛色变化等方面差异变化不大。各组小鼠喂养时间与各组体重变化成正相关,；实验开始前,各组体重组间比较,差异无统计学意义(P>0.05),表明体重基线一致；实验第8周开始到第16周时,DLT-H组均较Control组变轻,差异有统计学意义9(P<0.05,P<0.01)；而实验第12周开始,DLT-H组与Model组相比,差异亦有明显统计学意义(P<0.01)；实验第16周时,DLT-M组与Model组比较时,差异有统计学意义(P<0.05)。实验结果表明,DLT能控制ApoE-/-小鼠体重的增加,并呈剂量依赖性。小动物超声评价颈动脉AS形成情况：Control组的颈动脉血管声影均匀连续,管腔无见异常声影；Model组大部分小鼠的颈动脉血管声影不均匀连续,与周围组织(甲状腺为参照物)相比,部分血管壁呈强回声光影,表明血管明显增粗增厚,甚者有异常声影浮凸于血管壁,以颈动脉分叉处明显多见；DLT-L组的颈动脉亦可见到不均匀连续的强回声光影；DLT-M、DLT-H组及LPT组情况逐渐改善减轻。小鼠血清血脂情况：实验结束后,Model组的低密度脂蛋白(low density lipoprotein, LDL-C)、总胆固醇(total cholesterol, TC)、甘油三酯(triglyceride, TG)与Control组比较,差异有统计学意义(P<0.01)；与Model组比,DLT-L、DLT-M、 DLT-H和LPT各组的TG水平均降低,差异有统计学意义(P<0.05)；与Model组相比,DLT-M、DLT-H和LPT各组的LDL-C水平均降低,差异有统计学意义(P<0.05)；与Model组相比,DLT-H组和LPT组其TC水平均下降,差异均有明显的统计学意义(P<0.05)。实验表明,DLT各组小鼠的血脂水平逐步降低,呈剂量依赖。HE染色观察血管病理形态学的变化：Model组主动脉血管壁可见比较典型的斑块形成,血管的内皮细胞脱落明显,大面积的斑块沉积附着在血管内壁,甚至突出管腔,内弹力板尚且完整,内膜明显增生增厚,镜下可见大量巨噬细胞吞噬脂质而形成的泡沫细胞,中膜、外膜平滑肌细胞增生迁移,不规则增厚,亦可见散在的泡沫细胞浸润,说明小鼠AS造模成功；与Model组比较,DLT各组及LPT组小鼠的主动脉AS病变泡沫细胞浸润逐步减少,DLT-H组及LPT组的管壁内皮细胞尚连续,中外膜与Control组厚度相当,较Model组薄。结果显示DLT呈剂量依赖性的减少斑块形成,抑制血管平滑肌细胞增殖重构。CD68免疫组化染色观察AS斑块巨噬细胞浸润情况：与Control组相比,Model组ApoE-/-小鼠主动脉AS斑块内CD68表达(棕黄色颗粒)明显增加；与Model组相比,DLT各组ApoE-/-小鼠主动脉AS斑块内CD68表达(棕黄色颗粒)依次减少,呈剂量依赖,而LPT组ApoE-/-小鼠CD68表达(棕黄色颗粒)没有明显变化,提示DLT抑制高脂饮食喂养的ApoE-/-小鼠主动脉巨噬细胞浸润。2.丹蒌片对巨噬细胞泡沫化的影响MTT法观察DLT对细胞毒性：MTT检测结果表明,随着干预时间的延长,各组细胞的抑制率随着时间和剂量增多而逐步升高,呈现时间和剂量依赖性细胞生长记录情况：Model组比Control组细胞指数小,说明形成泡沫细胞会引起细胞指数下降。加入DLT之后细胞指数明显高于Model组,表明DLT能明显抑制泡沫细胞形成。油红0染色：Model组和DLT低剂量组DLT20 μg/ml及DLT中剂量组DLT1000μg/m1三组脂滴明显增多,以成团的大脂滴为主；Model组比较,DLT高剂量组DLT2000 μg/ml脂滴则减少,以散在的小脂滴为主。与Model组比较,DLT高剂量组DLT2000μg/ml红色脂滴面积明显减少,差异有统计学意义(P<0.05)。流式分析泡沫细胞内的MFI值：结果提示DLT中剂量及高剂量各组跟Model组相比,从孵育2h开始便能明显降低MFI,P<0.05,差异有明显的统计学意义。并且自DLT500μg/ml起,MFI峰值逐渐往左移动,即MFI逐渐下降,并呈剂量依赖,时间依赖。CD36的mRNA表达：与Control相比,Model组的CD36的mRNA相对表达量明显增多,差异有明显的统计学意义(P<0.01)；与Model组相比,DLT2000组的CD36的mRNA相对表达量明显减少,差异亦有明显的统计学意义(P<0.01)。LOX-1的mRNA表达：与Control相比,Model组的LOX-1的mRNA相对表达量明显增多,差异有明显的统计学意义(P<0.01)；与Model组相比,DLT2000组的LOX-1的mRNA相对表达量明显减少,差异亦有明显的统计学意义(P<0.01)。ABCAl的mRNA表达：与Control组相比,Model组ABCAl的mRNA的相对表达量明显降低,差异有明显的统计学意义(P<0.01)；而与Model组相比,DLT2000组的ABCAl的mRNA相对表达量增多,差异有统计学意义(P<0.05)。3.丹蒌片对小鼠AS炎症的影响小鼠脾细胞悬液中Thl-IFNγ的百分比含量：与Control组相比,Model组的Thl-IFNγ的百分比含量明显升高,差异有明显的统计学意义(P<0.01。与Model组相比,DLT-L组无明显差异,无统计学意义(P>0.05), DLT-M、DLT-H组的Thl-IFNγ的百分比含量均明显下降,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)；与Model组相比,LPT组的Thl-IFNγ的百分比含量均明显下降,差异有明显的统计学意义(P<0.01)。TNF-a蛋白信号的表达：各组的TNF-a蛋白信号值均大于200,Model组与DLT-H组比较,倍数变化为1.496,表明DLT-H组干预后炎症因子TNF-α的表达有明显的差异。IFN-γ蛋白信号的表达：各组的IFN-γ蛋白信号值均大于200,Model组与DLT-H组比较,倍数变化为1.662,表明DLT-H组干预后炎症因子IFN-γ的表达有明显的差异。TNF-a的mRNA表达：ApoE-/-小鼠AS模型的血管组织,与Control组相比,Model组的TNF-α的mRNA相对表达量明显升高,差异有明显的统计学意义(P<0.01)；与Model组相比,DLT-L组、DLT-M组和DLT-H组的TNF-α的mRNA相对表达量均降低,,差异有明显的统计学意义(P<0.01)。表明DLT呈剂量依赖性的下调动脉粥样硬化模型ApoE-/-小鼠炎症因子TNF-α的mRNA相对表达量。IFN-γ的mRNA表达：ApoE-/-小鼠AS模型的血管组织,与Control组相比,Model组的IFN-γ的mRNA相对表达量明显升高,差异有明显的统计学意义(P<0.01)；与Model组相比,DLT-L组、DLT-M组和DLT-H组的IFN-γ的mRNA相对表达量均降低,,差异有明显的统计学意义(P<0.01)。表明DLT呈剂量依赖性的下调动脉粥样硬化模型ApoE-/-小鼠炎症因子IFN-γ的mRNA相对表达量。4.丹蒌片对巨噬细胞泡沫化炎症的影响TNF-a蛋白信号的表达：各组的TNF-a蛋白信号值均大于200,Model组与Control组比较,倍数变化为1.207；与DLT20组比较,倍数变化为1.214；与DLT2000组比较,倍数变化为1.311。实验表明DLT2000组能够明显的降低炎症细胞因子TNF-α的表达。IFN-γ蛋白信号的表达：各组的IFN-γ蛋白信号值均大于200,Model组与DLT2000组比较,倍数变化为1.380。实验表明DLT2000组能够明显的降低炎症细胞因子IFN-γ的表达,具有明显的抗炎作用。TNF-α的mRNA表达：RAW264.7巨噬泡沫化细胞,与Control组相比,Model组的TNF-α的riRNA的相对表达量明显增多,差异有统计学意义(P<0.05)；与Model组比较,DLT2000组的TNF-α的mRNA的相对表达量明显降低,差异有明显的统计学意义(P<0.01)。IFN-γ的mRNA表达：RAW264.7巨噬泡沫化细胞,与Control组相比,Model组的IFN-y的mRNA的相对表达量明显增多,差异有明显的统计学意义(P<0.01)；与Model组比较,DLT2000组的IFN-γ的mRNA的相对表达量明显降低,差异有明显的统计学意义(P<0.01)。TLR4的mRNA表达：RAW264.7巨噬泡沫化细胞,与Control组相比,Model组的TLR4的mRNA的相对表达量明显增多,差异有明显的统计学意义(P<0.01)；与Model组比较,DLT2000组的TLR4的mRNA的相对表达量明显降低,差异有明显的统计学意义(P<0.01)。结论DLT通过下调CD36和LOX-1的表达,减少结合及吞噬oxLDL,上调ABCAl的表达,促进巨噬细胞内oxLDL及胆固醇等外流,降低血脂,并抑制巨噬细胞的泡沫化,从而减少动脉斑块形成。DLT还能够抑制斑块内的巨噬细胞的浸润,抑制TLR4的基因表达,并减少巨噬细胞分泌的炎症细胞因子,缓解血管慢性炎症,从而发挥防治AS的作用。