【摘 要】
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目的本研究通过体外细胞学实验,将探究NIPBL基因在小鼠骨髓间充质干细胞成软骨分化能力的影响,探索TGF-β1/Smad信号通路在Cornelia de Lange综合征模型小鼠骨髓间充质干细胞成软骨分化中的作用和可能机制,探讨NIPBL基因与TGF-β1/Smad信号通路在Cd LS骨骼发育中的相关性,将从分子层面剖析NIPBL基因在Cornelia de Lange综合征发病中的作用机制,为该
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目的本研究通过体外细胞学实验,将探究NIPBL基因在小鼠骨髓间充质干细胞成软骨分化能力的影响,探索TGF-β1/Smad信号通路在Cornelia de Lange综合征模型小鼠骨髓间充质干细胞成软骨分化中的作用和可能机制,探讨NIPBL基因与TGF-β1/Smad信号通路在Cd LS骨骼发育中的相关性,将从分子层面剖析NIPBL基因在Cornelia de Lange综合征发病中的作用机制,为该疾病的临床有效干预提供新的思路。方法利用培养至第三代C57小鼠骨髓间充质干细胞开展本研究。构建3种携带NIPBL-sh RNA的慢病毒载体转染小鼠骨髓间充质干细胞,通过倒置荧光显微镜观察慢病毒转染效率,使用实时荧光定量聚合酶链反应法（RT-q PCR）检测NIPBL基因的m RNA表达量,根据RT-q PCR的结果选择效果最佳的一种慢病毒载体作为实验组。后续实验组分别包括:抑制NIPBL基因表达的实验组（sh-NIPBL组）、未携带目的基因的慢病毒空载体干预的阴性对照组（sh-NC组）和未进行慢病毒干预的空白对照组（Control组）。慢病毒干预得到转染稳定株后,分别将3组细胞成软骨诱导分化培养,于诱导的第21天:测量比较3组软骨微球的最大横截面周长,观察3组阿利辛蓝染色软骨细胞的结果,行免疫荧光染色,观察CollagenⅡ的分布与含量,Western blot检测Sox9、CollagenⅡ、TGF-β1、Smad2、Smad4基因的蛋白表达水平;分别在诱导的第3天、7天、14天、21天提取3组细胞的总RNA,用RT-q PCR法检测Sox9、CollagenⅡ、TGF-β1、Smad2、Smad4基因的m RNA表达水平。结果（1）慢病毒干预小鼠骨髓间充质干细胞后,RT-q PCR检测结果显示NIPBL基因m RNA表达量明显降低（P＜0.05）,其中以MOI=60 sh-NIPBL-3敲低效果最佳,用其进行后续实验研究。（2）成骨诱导第21天,Alcian blue染色后在倒置显微镜下观察sh-NC组和Control组较实验组可见更多的蓝色软骨内酸性黏多糖,且软骨微球的最大横截面周长更长。（3）sh-NIPBL组骨髓间充质干细胞中CollagenⅡ、Sox9的蛋白表达量均低于对照组（P＜0.05）;（4）sh-NIPBL组在成软骨诱导后,TGF-β1、Smad2、Smad4基因和蛋白的表达水平均低于对照组（P＜0.05）;结论慢病毒敲低NIPBL基因的表达降低了骨髓间充质干细胞的成软骨分化能力,TGF-β1/Smad信号通路中的TGF-β1、Smad2、Smad4基因和蛋白表达水平也随之下降,说明TGF-β1/Smad信号通路可能参与介导了由NIPBL基因突变所致的Cd LS骨骼发育异常的过程。
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