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研究背景： 蛋白磷酸化水平由蛋白激酶和蛋白磷酸酶进行精细的协同调节，影响细胞很多方面的生理功能。蛋白酪氨酸磷酸酶(Protein tyrosine phosphatases，PTP)家族是细胞信号转导的重要调节因子。研究显示，所有的经典的PTP的催化机制基本相同，并已经得到比较清晰的阐述。之前的研究主要集中在活性中心的第一层氨基酸，即直接参与底物结合或催化的氨基酸。而对于第二层氨基酸的关注则相对较少。然而，第二层氨基酸对PTP的催化活力与底物识别特异性同样具有潜在的重要性，值得我们深入研究。 研究目的： 研究活性中心第二层氨基酸残基T263对PTP1B(Protein tyrosine phosphatases1B，PTP1B)磷酸酶活力和功能的调节 材料与方法： 本文以pT7-7-PTP1B，cDNA4-PTP1B质粒为模板，构建Thr263的突变体。首先将cDNA4-PTP1B野生型及Thr263突变型质粒转染入HepG2细胞中，通过检测PTP1B负调控胰岛素信号通路的能力来确定PTP1B野生型及Thr263突变蛋白活性的差异。然后将pT7-7-PTP1B野生型及Thr263突变型质粒转化入E.coliBL21中进行表达，并使用CM弱阳离子交换柱以及分子筛纯化表达的蛋白。将纯化的蛋白进行蛋白结晶，研究Thr263对蛋白结构的影响。选择pNPP、磷酸化短肽作为底物来观察Thr263突变对PTP1B基本酶活的影响。通过检测Thr263突变体的kcat、 Km、kcat/Km，阐明Thr263突变如何改变PTP1B去磷酸化的过程。通过测定其对pH依赖性和解离基团pKa的依赖性，来阐明Thr263在PTP1B催化中的作用。最后通过对PTP1B及Thr263突变蛋白结构的解析，直观阐明Thr263在PTP1B蛋白空间结构中的作用。 结果： 细胞实验显示，Thr263突变使PTP1B活性降低，其负调控胰岛素信号通路的能力减弱。蛋白基本活力的测定结果显示Thr263突变蛋白的磷酸酶活性减弱，Thr263突变同时影响酶的kcat和Km。从晶体结构上看，Thr263与胰岛素受体(Insulin receptor, IR)的1164位R相互之间有疏水作用，而与表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor, EGFR)没有此作用，进一步显示Thr263能影响PTP1B的底物特异性。PTP1B及其突变体的pH和底物解离基团的依赖性研究，证实Thr263突变影响了PTP1B的酸碱催化机制中通用酸的功能，同时影响蛋白的催化反应和底物结合两个方面。PTP1B及Thr263突变蛋白的晶体结构分析，显示T263与F182的疏水作用对稳定WPD loop有重要作用，而突变破坏了这种作用，进而影响PTP1B的酶活和底物选择性。 结论： 1.第二层氨基酸Thr263在PTP1B调控胰岛素信号通路中起重要的作用。Thr263突变使PTP1B对胰岛素信号通路的负调控作用降低甚至消失。 2.PTP1B Thr263突变使PTP1B的体外催化活性明显降低. 3.Thr263突变能够影响PTP1B催化的化学反应过程和底物结合过程。 4.Thr突变蛋白扰乱通用酸Asp181的功能，使蛋白活性降低。 5.PTP1B T263通过与F182的疏水作用来稳定通用酸Asp181，调控WPD loop移动，进而稳定底物解离。 6.T263∶F182之间的疏水作用是磷酸酶活性和底物特异性识别的决定性因素。