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小热休克蛋白（Small heat shock proteins,sHsps）是热激蛋白家族重要的成员,不仅在生物应对不良环境胁迫中发挥重要作用,而且与昆虫滞育密切相关。麦红吸浆虫Sitodiplosis mosellana（Géhin）是一种典型的具有专性滞育的农业昆虫,滞育过程中经历酷暑和严寒。为弄清sHsps基因在麦红吸浆虫滞育中的作用,探讨其对麦红吸浆虫滞育的调控与激素的关系,本研究采用RT-PCR和基因组步移（Genome Walking）技术克隆麦红吸浆虫SmHsp17.4和SmHsp20.3基因cDNA、DNA及启动子序列;通过实时荧光定量PCR技术分析两个基因在麦红吸浆虫滞育进程、短期极端高、低温胁迫及外源激素（20 E）处理下的表达模式,并获得有活性的重组蛋白,通过苹果酸脱氢酶（MDH）热聚沉试验,进行体外分子伴侣功能研究,主要结果如下:1.克隆获得的麦红吸浆虫SmHsp17.4（MK714040）和SmHsp20.3（MK714041）基因编码区cDNA序列分别为456和543 bp,分别编码151和180个氨基酸残基,预测的蛋白分子量分别为17.4和20.3 k Da,等电点分别为6.87和5.80。序列分析表明,两个基因推导的氨基酸序列均含有sHsps家族保守的α-晶体结构域和Ibp A结构域;两个蛋白氨基酸序列相似性42.94%,均与冈比亚按蚊sHsps相似性较高（47%以上）,亲缘关系较近。基因组DNA与cDNA序列进行比对结果显示,SmHsp20.3没有内含子,SmHsp17.4含有1个长为85 bp的内含子。2.为探明SmHsp17.4/20.3基因的表达调控机理,根据其c DN A编码区的5′-末端核苷酸序列,利用基因组步移技术,分别克隆获得了位于起始密码子（ATG）上游1272和1186 bp的序列;利用NNPP软件分别在SmHsp17.4/20.3起始密码子上游189和59 bp处预测到转录起始位点。序列分析发现,SmHsp17.4/20.3启动子序列不仅含有启动子核心元件TATA-box和CAAT-box,还包含热休克元件（HSE）、GATA模序和核因子NF-,SmHsp17.4同时预测到2个蜕皮激素响应元件DBRC。3.SmHsp17.4/20.3基因在麦红吸浆虫滞育不同时期的表达量均存在显著差异,但二者在滞育进程中的表达模式不同。SmHsp17.4进入滞育后表达量显著下调;滞育期间,10月前维持在较低水平,但11月即向滞育后的过渡期表达量显著上调,滞育后静息期的1月达到最高,随后显著下降,恢复发育的初期降至最低,其表达量变化与该虫滞育进程蜕皮激素（20 E）滴度变化趋势相似,也与该基因启动子序列含有20 E响应元件DBRC一致,说明其在滞育中的表达可能受20 E的调控。与SmHsp17.4不同,整个滞育进程中,SmHsp20.3在夏季8月和冬季12月的表达量显著高于滞育前、恢复发育后和滞育期其它阶段。4.采用qPCR技术分析了SmHsp17.4/20.3对越夏滞育幼虫在35～50℃极端高温、越冬滞育幼虫在0～-15℃极端低温胁迫1 h后的响应,发现35℃、40℃和-10℃处理越夏或越冬滞育幼虫可显著诱导两个基因的表达,但超过45℃、低于-15℃的时诱导效果不明显。两个基因在极端温度胁迫下的表达也与胁迫时长及胁迫后恢复时长有关,二者均在35℃和-10℃处理30-60 min及35℃处理1 h恢复30 min后表达水平明显升高,SmHsp17.4在-10℃处理1h恢复30-240 min后的表达水平也显著提高,但SmHsp20.3在处理1h恢复30-240 min后的表达与对照（未处理幼虫）差异不明显。5.为明确蜕皮激素对麦红吸浆虫滞育幼虫SmHsp17.4/20.3表达的影响,分析了不同浓度（0.1～0.6 pg/n L）20 E处理滞育幼虫后不同时间（3、6和12 h）基因的表达量变化。结果表明,20 E应用对SmHsp20.3表达无影响,但可显著诱导SmHsp17.4的表达,其表达量变化与20 E浓度和时间紧密相关,其中0.4 pg/n L浓度在处理后6 h的诱导效果最明显,其表达量为未处理对照的3.6倍。6.以pET28a（+）为表达载体成功表达并纯化获得有活性的SmHsp17.4/20.3重组蛋白,纯化蛋白的浓度分别为36.61和4.15μM。抑制猪心苹果酸脱氢酶（MDH）热聚沉试验结果显示,SmHsp17.4/20.3能抑制MDH免遭高温（43℃）变性,具有显著的体外分子伴侣活性。综上所述,麦红吸浆虫SmHsp17.4/20.3基因的表达均与滞育进程密切相关,SmHsp20.3在夏季、冬季及短期极端高、低温胁迫下均上调表达,推测可能在滞育期间的耐热和耐寒性中发挥作用。根据SmHsp17.4基因启动子序列转录调控元件、在滞育进程及20 E处理下的表达模式,说明该基因在自然滞育中的表达受20 E的调控,其在滞育向滞育后发育过渡期的上调表达可作为预测滞育终止的分子标记;该基因在一定范围短期极端温度胁迫下也上调表达,可通过抑制MDH的聚沉在应对极端温度的胁迫中发挥作用。该研究结果不仅有助于深入了解麦红吸浆虫滞育的分子调控机理,而且为探究滞育过程中对逆境的适应机制以及相关的农业防控策略提供了分子基础。