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亚洲小车蝗Oedaleus asiaticus是中国北方草原和农牧交错带中最具优势和经济重要性的蝗虫种类之一,在爆发期间往往需要化学防治。该种蝗虫主要以禾本科植物为食,喜欢过度放牧的草原和旱生栖息地,是内蒙古草原退化的指示物种。昆虫主要以嗅觉感受系统识别生境中的化学气味分子,从而引导昆虫觅食、交配、选择产卵地点和躲避天地等生命活动。并且通过各种嗅觉蛋白之间的相互作用来检测气味分子,所以嗅觉相关蛋白是昆虫嗅觉活动的分子基础。然而,西前关于亚洲小车蝗嗅觉功能的研究信息很少,所以对其嗅觉相关蛋白基因的挖掘以及功能研究有利于明确其化学感受机制,同时也为找寻蝗虫绿色防治的分子靶标提供理论依据。本研究利用亚洲小车蝗触角转录组数据鉴定出嗅觉相关蛋白基因,对其进行生物信息学以及表达谱分析,并对主要的化学感受蛋白基因进行原核表达,然后测定该蛋白与不同配体的结合能力,最后通过RNA干扰结合触角电位对其干扰效应进行检测。上要结果如下:1.亚洲小车蝗嗅觉相关蛋白基因的鉴定根据本实验室组装的亚洲小车蝗触角转录组数据库,通过生物信息学方法分析,共鉴定出86个嗅觉相关蛋白白基因,包括17个化学感受蛋白基因(chemosensory protein,CSP)、60个气味受体基因(odorant receptor,OR)(包括59个普通气味受体基因OR和一个共受体ORco)、6个离子型受体基因(ionotropic receptor,IR)和3 个感觉神经元膜蛋白基因(sensory neuron membrane protein,SNMP)。17 个 CSPs中除OCsiCSP19外,其它16个OasiCSP基因具有完整的开放阅读框(open reading frame,ORF),其长度范围为372 bp至516 bp;氨基酸序列的多重比对表明这些OasiCSP含有4个保守的半胱氨酸残基。60个OR基因中只有OasiOR14、Oasi和R15和OasiORco具有完整的ORF,长度分别为1350 bp、1194 bp和1146 bp,它们编码的蛋白质含有4～7个跨膜结构域;6个IR具有1～4个跨膜结构域,除OasiIRI和OasiIR76b之外的其它4个OasilR具有16至19个氨基酸的信号肽,只有OasiIR8a和OasiIR25a具有全长的ORF;3个SNMPs有1～2个跨膜结构域,并且氨基酸序列比对发现SNMP含有6个保守的半胱氨酸残基。BlastP验证的最佳结果和系统发育分析均显示,这些嗅觉相关蛋白与来自直翅目的东亚飞蝗Locusta migaatoia或沙漠蝗Schier gregaria的嗅觉相关蛋白亲缘关系最近。2.亚洲小车蝗嗅觉相关蛋白基因的组织表达谱分析应用qRT-PCR分析嗅觉相关蛋白基因在雌雄成虫不同组织(触角、去除触角和口器的头、上唇、去掉下唇须的下唇、下唇须、下颚须、胸部、跗节、翅和腹部)中的表达模式。结果显示,8个CSP基因在成虫不同组织中的表达水平存在显著差异,特别是OasiCSP8在下唇须和下颚须中高表达,而OasiCSP11和OasiCSP13在触角中表达量最高。OasiCSp15在化学感受器官(触角、上唇、去掉下唇须的下唇、下唇须、下颚须和跗节)中的表达量远高于非化学感受器官(去掉触角和口器的头部、胸部、翅和腹部)中的表达量,而OasiCSp12在几乎所有测定的组织中具有相似的表达分布;14个OR和2个SNMP基因(OasiSNMP1和OasiSNMP2a)在成虫触角中强烈表达,并且几乎所有测试的基因在雌雄之间的表达水平具有显著差异。此外,2个IR基因(CasiIR25a和CasiIR76b)在触角,下唇须和下颚须中高表达,而3个IR基因(OasiIR1、OasiIR2和OasiIR3)在大多数组织中高表达(去掉触角和口器的头部、下唇须、下颚须、无下唇须的下唇、胸部、跗节和腹部),但OasiIR25a只在触角、去掉下唇须的下唇、下唇须、下颚须以及腹部中微弱表达。3.亚洲小车蝗化学感受蛋白荧光竞争结合测定构建了 8个OasiCSPs的重组表达质粒并在大肠杆菌中成功表达,用Ni亲和层析柱成功纯化蛋白,并测定了来自寄主植物克氏针茅Stipa krylovii挥发物、亚洲小车蝗粪便挥发物以及亚洲小车蝗成虫体表挥发物共16种气味化合物对这8种CSP蛋白的结合能力。结果表明,8种蛋白对各种挥发物表现出不同程度的结合能力,除了OasiCSP11对1种成虫体表挥发物(2-乙基己醇)表现出最高的结合能力(Ki值为9.84μM),OasiCSP12对大多数挥发物的结合能力高于其它7种蛋白,其中对5种寄主植物挥发物(正己醛、叶醇、乙酸丁酯、甲苯、三甲苯)和1种成虫体表挥发物(2-乙基己醇)表现出强的结合能力(Ki<20 μμM),尤其对乙酸丁酯和叶醇的结合力最强,Ki值分别为13.73与14.73 μM。OasiCSP15对供试化合物的结合力最弱,并且只结合2种气味化合物。4.亚洲小车蝗化学感受蛋白基因RNA干扰效应为进一步验证化学感受蛋白的嗅觉功能,进行了 RNA干扰(RNAinterference,RNAi)和电生理反应试验。在亚洲小车蝗雌雄成虫中分别注射3种dsCSPs(OasiCSP4-dsRNA、OasiCSP11-dsRNA 和 OasiCSP12-dsRNA)48 h后,qRT-PCR 检测显示,与注射水和非注射的对照组相比,注射dsCSP12后显著降低了雌雄触角中的靶基因表达水平,而在注射dsCSP4和dsCSP11后,OasiCSP4和OasiCSP111的表达水平在雌性中显著降低,但在雄性中没有显著差异。16种气味化合物对不同注射处理后的雌雄成虫进行触角电位检测显示,在dsCSP4处理后,雌触角只对3种化合物(反式-2-己烯醛、顺-3-己烯-1-醇和甲基丙烯醛)的触角电位(Electroantennogram,EAG)反应显著降低;雄触角对12种化合物的反应显著降低;并且在雌雄触角中,2-甲基丁醛在dsCSP4注射后反而引起更强的反应。沉默OasiCSP11后显著降低了雌触角对13种化合物的EAG反应,雄触角对4种化合物的反应显著降低。注射dsCSP12后雌雄触角对化合物的EAG反应最明显,雌触角对所有气味化合物的EAG反应显著降低,而雄触角除了对反式-2-己烯醛、顺-3-己烯-1-醇和庚醛外,对其它13种化合物的EAG反应也显著降低。上述结果表明,这3个CSP在亚洲小车蝗寻找寄主植物和聚集行为中可能起着重要作用。