论文部分内容阅读
杨树三倍体品种在林业生产中的突出表现证明,杨树多倍体育种具有巨大的挖掘潜力。细胞融合和体细胞染色体加倍是获得杨树多倍体种质的有效途径之一。本文以小青杨(Populus pseudo-simonii Kitag.)、北京杨(P.×beijingensis)为材料,在建立离体再生体系以及悬浮细胞培养体系的基础上,开展了原生质体分离、培养,以及施加秋水仙碱处理诱导小青杨离体叶片细胞染色体加倍研究,为细胞融合途径获得杨树体细胞杂种以及诱导离体组织染色体加倍途径创造杨树四倍体新种质打下了一定的基础。主要研究结果如下：1.研究了小青杨单芽茎段培养和愈伤组织再生技术,为进一步开展离体叶片细胞染色体加倍以及原生质体培养奠定了基础。小青杨单芽茎段在含NAA 0.05 mg/L的MS培养基中启动腋芽萌发,在含IBA0.5 mg/L的1/2MS培养基生根率达100%。用下胚轴和不带芽茎段为材料诱导愈伤组织,在MS附加2,4-D 2 mg/L, BA 0.05～0.1mg/L诱导效果最佳,愈伤组织颜色鲜黄,呈颗粒状；愈伤组织再分化的最适激素配比为BA1.0 mg/L和NAA 0.2mg/L,在此条件下8w即可分化出绿色不定芽。2.建立了小青杨悬浮细胞培养体系,为原生质体培养奠定了基础。小青杨茎段来源的愈伤组织建立的悬浮细胞系,在含2,4-D 2 mg/L、BA0.1 mg/L、ME 500 mg/L谷氨酰胺1500 mg/L和4%蔗糖的MS液体培养基中细胞分裂旺盛,生长特性呈S型曲线,继代周期为12d；长期在含高浓度2,4-D的培养基上培养不利于保持细胞分化能力,应根据悬浮细胞生长状态定期调整2,4-D和BA浓度；采用固体-液体轮回培养法,可以对培养物进行长期保存。3.研究建立了小青杨和北京杨叶肉和悬浮细胞原生质体分离技术体系。小青杨叶肉原生质体分离的最佳条件为将培养35 d的叶片置于含3.0%纤维素酶R-10、0.5%离析酶R-10、0.1%果胶酶Y-23和0.6 M甘露醇的混合酶液中酶解8 h,原生质体产量和活力分别达到2.44x 10~7个/g和78.7%。小青杨和北京杨悬浮细胞原生质体分离条件类似,适宜酶解液配比组合均为1.0%纤维素酶RS、0.5%离析酶R-10和0.6 M甘露醇,将培养6d的处于对数生长期的小青杨和北京杨下胚轴悬浮细胞分别酶解6h和4 h,可以获得产量和活力表现俱佳的原生质体。4.研究了小青杨和北京杨原生质体培养技术,获得了再生植株。原生质再生与原始材料来源密切相关,源于叶肉的小青杨原生质体培养甚至难以获得愈伤组织,而源于下胚轴悬浮细胞的小青杨、北京杨原生质体培养均可以获得再生植株。在小青杨和北京杨悬浮细胞原生质体培养中,以2×10~5个/mL的密度培养在附加2,4-D 2 mg/L、BA 0.2 mg/L和0.6 M葡萄糖的液体MMS培养基植板率最高；原生质体愈伤组织经1-2次增殖培养后可进行分化诱导,其中小青杨原生质体愈伤组织在含BA 1.0 mg/L和NAA 0.1 mg/L的培养基上分化率最高,北京杨原生质体愈伤组织则在含BA 0.5mg/L和NAA 0.1 mg/L的培养基上分化率最高；原生质体再生植株均在含0.5 mg/LIBA的1/2MS培养基上生根良好。5.首次通过施加秋水仙碱处理诱导小青杨离体叶片细胞染色体加倍获得了四倍体植株。诱导小青杨叶片再生植株的最适激素组合是BA0.4 mg/L和NAA0.2 mg/L,叶片分化率达75.2%；将预培养6d的叶片在秋水仙碱浓度为30 mg/L的液体培养基中处理3d后,转入叶片再生培养基培养,嵌合体比率低,可以获得源于单细胞染色体加倍的四倍体,四倍体植株诱导率最高达14.6%。对经过5次继代的36株四倍体进行倍性检测,其倍性水平仍表现稳定。