论文部分内容阅读
目的:明确肝龙胶囊的抗肝纤维化作用,并探讨其作用机制,为肝龙胶囊治疗肝纤维化的临床研究提供实验依据。方法:以6周龄雄性SD大鼠为实验对象,随机将大鼠分为正常组（n=8）和造模组（n=40）,造模组腹腔注射CCl4诱导大鼠的慢性肝损伤,构建肝纤维化模型。造模成功后,再将大鼠随机分为正常组、模型组、阳性药秋水仙碱组（0.2 mg/kg）、肝龙胶囊低剂量组（62.5mg/kg）、肝龙胶囊中剂量组（125 mg/kg）及肝龙胶囊高剂量组（250 mg/kg）,每组8只,正常组和模型组以生理盐水灌胃,药物组以相应药物灌胃,每天给药1次。连续给药4周后,经腹主动脉取血并收集肝脏。检测各组大鼠的血清生化指标、血清纤维化指标以及肝组织Hyp水平;苏木精-伊红染色法（Hematoxylin-eosin staining,HE染色法）和Masson染色法观察各组大鼠肝脏组织的病理学改变情况;酶联免疫吸附试验（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测各组大鼠肝组织的TNF-α、IL-1β、IL-6,探究肝龙胶囊对肝纤维化大鼠炎症水平的影响;检测各组大鼠肝组织的MDA、SOD,探究肝龙胶囊对肝纤维化大鼠氧化应激水平的影响;免疫蛋白印迹法（Western Blot,WB）和实时定量聚合酶链反应（Real Time Quantitative PCR,RT-q PCR）检测各组大鼠肝组织的凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Caspase3和TGF-β1/Smad通路相关蛋白TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7,以及m RNA的相对表达量,探究肝龙胶囊对肝纤维化大鼠肝细胞凋亡及TGF-β1/Smad通路的影响;免疫组织化学法（Immunocytochemical,ICC）检测各组大鼠肝组织中α-SMA、COL-I、COL-Ⅲ、MMP-1及MMP-2的表达,RT-q PCR法检测各组大鼠肝组织的α-SMA、COL-I、COL-Ⅲ、TIMP-1、MMP-2、MMP-9 m RNA的相对表达量,探究肝龙胶囊对肝纤维化大鼠胶原表达及细胞外基质降解的影响。结果:（1）肝纤维化大鼠皮毛杂乱、体重增加缓慢,肝脏粘连严重、色暗质硬,肝脏指数增高（P＜0.05）。肝龙胶囊治疗后大鼠的状态得到改善,肝脏粘连程度减轻,肝脏指数逐渐趋于正常;模型组大鼠血清中AST、ALT、ALP、HA、LN、PC-Ⅲ含量明显高于正常组（P＜0.05）,ALB含量低于正常组（P＜0.05）,肝组织中Hyp含量高于正常组（P＜0.05）,肝龙胶囊能够改善上述指标的病理性改变,提示肝龙胶囊具有一定的安全性及改善肝损伤和减轻肝纤维化的作用;（2）HE染色结果显示,肝龙胶囊能够减少肝纤维化大鼠肝脏的炎性细胞浸润和纤维束形成;Masson染色结果表明,肝龙胶囊能够改善肝纤维化大鼠肝脏胶原纤维结缔组织的增生。上述结果进一步提示了肝龙胶囊能通过减少胶原产生来减轻肝纤维化程度;（3）ELISA实验结果显示,模型组大鼠肝组织中TNF-α、IL-1β和IL-6水平显著高于正常组（P＜0.05）,肝龙胶囊能够降低TNF-α、IL-1β和IL-6水平（P＜0.05）,表明肝龙胶囊能够减少促炎细胞因子的产生;（4）肝龙胶囊可以降低模型组大鼠肝组织中MDA的水平,提高SOD的活性,表明肝龙胶囊能够改善机体的过氧化损伤;（5）WB结果显示,模型组大鼠肝组织Bax、Caspase3、TGF-β1、Smad2、Smad3高表达（P＜0.05）,Bcl-2、Smad7低表达（P＜0.05）。肝龙胶囊能够下调Bax、Caspase3、TGF-β1、Smad2、Smad3的表达,上调Bcl-2、Smad7的表达。RT-q PCR实验结果显示同样的趋势。表明肝龙胶囊能够抑制肝细胞凋亡和TGF-β1/Smad通路;（6）ICC结果显示,模型组大鼠肝组织α-SMA、COL-I、COL-Ⅲ高表达（P＜0.05）,MMP-1、MMP-2低表达（P＜0.05）,肝龙胶囊能够下调α-SMA、COL-I、COL-Ⅲ的表达,上调MMP-1、MMP-2的表达;RT-q PCR实验结果显示,模型组大鼠肝组织α-SMA、COL-I、COL-Ⅲ、TIMP-1 m RNA相对表达量增高（P＜0.05）,MMP-2、MMP-9 m RNA相对表达量降低（P＜0.05）,肝龙胶囊能够抑制α-SMA、COL-I、COL-Ⅲ、TIMP-1 m RNA的表达,促进MMP-2、MMP-9 m RNA的表达。表明肝龙胶囊能够抑制胶原产生,促进细胞外基质的降解。结论:（1）肝龙胶囊具有改善肝损伤,减轻肝纤维化的作用,且具有一定的剂量依赖性;（2）肝龙胶囊的抗肝纤维化作用与降低炎症水平,减少氧化应激,抑制肝细胞凋亡,抑制TGF-β1/Smad通路,抑制胶原的合成与分泌,促进细胞外基质降解有关。