维生素B12是人体生长发育的必需营养素并广泛应用于医疗、饲料、食品等领域,国内外市场需求日益增加,维生素B12的合成途径十分复杂,需要30多步的酶催化反应,目前工业生产只能通过微生物发酵获得。我们通过诱变育种和高通量筛选相结合的方法,获得三株不同维生素B12的生产能力的菌株,通过检测它们的中间代谢产物,我们推测ALA的积累量和HBA转化成HBAD的转化率与维生素B12的产量呈正相关。故我们过表达hem A基因和cob B基因并通过摇瓶发酵检测维生素B12的产量。苜蓿中华根瘤菌320是我们实验室之前从土壤中分离得到的菌株,它含有合成维生素B12途径的全部基因。然而,在苜蓿中华根瘤菌中缺乏可有效促进基因表达的调控元件。在本论文中,我们基于GFP作为报告蛋白检测目标启动子的表达强度,我们构建了苜蓿中华根瘤菌320来源的PA或PB启动子都具有比相同来源的Para A启动子更高强度的诱导表达和更低的本底表达。还测定了葡萄糖或蔗糖对这三种启动子表达强度的影响,发现葡萄糖明显抑制这三种启动子的表达,Para A的表达最低。尽管蔗糖抑制PA的表达强度34.8%,而Para A的表达强度提高了16%,PA的表达强度仍是最高的,是Para A表达强度的1.13倍。然后,在苜蓿中华根瘤菌320中利用PA启动子分别过表达hem A基因和cob B基因,发现工程菌株的VB12产量与苜蓿中华根瘤菌320相比分别提高了10.9%和19.36%,丰富了可用于分析苜蓿中华根瘤菌320的工具库。苜蓿中华根瘤菌是重要的维生素B12工业生产菌株,目前缺乏对其进行基因编辑的有效工具,CRISPR/Cas9技术的发展为苜蓿中华根瘤菌的遗传改造提供了技术支持。在本论文中,我们构建了CRISPR/Cas9系统和NHEJ连接系统,并通过将含有Cas9切割系统的质粒通过三亲本转化法转入到苜蓿中华根瘤菌320中,验证CRISPR/Cas9系统的切割效率,发现Cas9系统在苜蓿中华根瘤菌中是有切割活性的,但在苜蓿中华根瘤菌320中,可能也存在未知的与Cas9靶向序列相似的序列。然而我们将CRISPR/Cas9系统和NHEJ连接系统联用,通过基因测序发现在Cas9的靶点位置没有产生突变,我们猜测可能是Cas9切割后的菌落并没有被NHEJ系统成功连接,长出的菌落是没有被Cas9切割的菌落。