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冬虫夏草[Cordyceps sinensis(Berk.)Sacc.]为中国传统的名贵滋补中药材,但是其天然资源匮乏,人工培养菌丝体作为天然冬虫夏草的代用品正日益受到人们的关注。本研究对冬虫夏草的深层培养条件进行了优化,比较了天然冬虫夏草和液体深层培养菌丝体的主要代谢产物含量和抗氧化、抗病毒活性的差异,以澄清冬虫夏草深层培养和代谢产物研究中的一些混乱,并为人工培养菌丝体代替天然冬虫夏草提供依据。
通过单因素试验研究了冬虫夏草菌丝生长的营养需求,最佳碳、氮源分别为碳源9和氮源15,最适碳氮比值为12:1(以碳氮元素含量计算),金属元素中元素1和元素8的作用最为重要,维生素中维生素4最有利于菌丝的生长。
采用不同地理来源的菌株研究了人工培养的环境条件对冬虫夏草菌丝生长的影响,发现其最适生长温度为15-18℃、25℃时停止生长,最适起始pH值为5.5—6.0,光照没有显著的作用,最适装瓶量为三角瓶容积的1/5,最佳转速为100 rpm,最佳接种量为10-20%。
通过正交试验设计优化了冬虫夏草菌丝生长的培养基,得到半合成培养基的配方为碳源9:5%,氮源15:1%,维生素10:0.3%,金属元素3:0.1%和金属元素2:0.05%;复合培养基配方为天然原料1:5%,碳源9:2%,天然原料2:20%,天然原料3:0.3%,氮源15:0.5%。最佳培养条件下菌丝体产率可达到24 gl-1以上,周期缩短至25 d。
人工培养菌丝体核苷和甘露醇的含量测定结果表明其含量与菌株的地理来源之间没有明显的相关性;聚类分析表明腺苷和甘露醇的含量作为质量标准不能很好地区分冬虫夏草及其代用品。天然冬虫夏草的腺苷、甘露醇含量及必需氨基酸百分比高于人工培养的菌丝体;而人工培养菌丝体的氨基酸总量高于天然冬虫夏草。
采用Box-Behnken响应曲面法优化了人工培养菌丝体多糖的提取工艺,在温度88.9℃、时间1.83 h、提取3次的条件下,提取率为15.85%。对人工培养菌丝体多糖和发酵液多糖经过脱蛋白、脱色和透析,采用DEAE-52柱层析进行了纯化,经Sephadex G-100柱层析和紫外检测确认菌丝体多糖MPS1和发酵液多糖EPS1、EPS2分别为单一组分。
天然和人工培养冬虫夏草菌丝体的水提物在6种抗氧化体系中均显示了显著的抗氧化能力并具有相似的趋势,即IC50值在亚油酸过氧化体系中最低,在还原能力体系中最高。人工培养菌丝体水提物清除DPPH和超氧阴离子自由基的能力和还原能力稍强于天然菌丝体的水提物,而两者对亚油酸过氧化的抑制和羟基自由基的清除能力相似。抗氧化活性和糖、蛋白质、甘露醇含量之间没有明显的相关性,可能是多种成分综合作用的结果。冬虫夏草菌丝体水提物可以通过直接的自由基清除能力、金属螯合和还原能力来发挥其抗氧化作用。
人工培养冬虫夏草菌丝体水提物对病毒A的CC50值低于天然水提物,抗病毒能力更强;多糖是其抗病毒作用的主要有效成分;通过抑制病毒A对细胞的感染和增殖来发挥作用。
通过分析冬虫夏草研究中所用材料的可靠性,强调了化学和药理学研究中正确鉴定和详细描述所采用生物材料的重要性。