肿瘤是由一群异质性的细胞组成的，这些细胞处于不同的分化阶段，其中有一小部分细胞在肿瘤形成中发挥重要作用，这群细胞被称为肿瘤干细胞。肿瘤干细胞最早是在白血病患者体内中发现的，随后在一些实体瘤中，如脑胶质瘤、结肠癌、乳腺癌、胰腺癌等也证明存在一群具有相似功能的细胞，这群细胞具有自我更新、多潜能和未分化的特点。这群细胞在肿瘤中所占的比例极少，但在肿瘤的发生、发展、转移和复发中起到重要作用。因此肿瘤干细胞已经成为治疗肿瘤的重要靶点，以肿瘤干细胞为研究对象寻求治疗肿瘤的方法已经成为当今肿瘤学领域研究的热点。　　目前常采用的分离、纯化肿瘤干细胞的方法是依据细胞标志进行分选，但由于肿瘤中干细胞的数量极少，并且由于其具有的干细胞特性造成在体外培养过程中非常容易分化，因此要获得足够的干细胞进行研究较为困难，这限制了肿瘤干细胞的研究进展。特别是从原代组织中获取肿瘤干细胞更为困难，这不仅由于上述两点原因，还是由于临床上所得肿瘤组织有限，肿瘤干细胞在肿瘤组织中所占比例不恒定所致。因此如何有效地从细胞或组织中获取足够的肿瘤干细胞并在体外一段时间内维持其特性稳定是研究肿瘤干细胞亟待解决的问题。微球体培养最初用于神经干细胞和胚胎干细胞的体外培养，在特殊的培养条件下神经干细胞和胚胎干细胞能够保持其干细胞特性，并且以球体的形式存在。因此借鉴这种方法可在体外富集、扩增肿瘤干细胞。　　人体由无数细胞所组成，这些细胞发挥不同的作用才维持了整体的生物学活动，使人体能够正常运转。细胞内存在多种信号转导通路，这些信号转导通路相互交叉调控形成一个十分复杂的网络系统，调控细胞的生物学特性。肿瘤干细胞所具有的特性正是由其特有的信号转导调控网络调控的，常见的信号通路包括Wnt、Notch、Hedghog、TGF-β和PTEN等。以往的研究仅是对单一的基因、一种蛋白或一个反应进行检测，仅能了解整个调控网络的局部，而细胞的生物学特性是整个调控网络共同作用的结果，因此需要进一步从整体角度把握基因之间的相互关系。探索肿瘤干细胞的重要信号通路能够使我们更好的理解肿瘤干细胞，并以此为靶点治疗肿瘤。　　目前一类调控性非编码小RNA(MicroRNA)在调控干细胞自我更新、分化和增殖的研究中受到人们的关注。这类MicroRNAs在物种进化中非常保守，只在特定的组织和发育阶段表达，特定MicroRNAs的表达能够决定细胞的分化方向以及分化时相，并且大约50％的MicroRNAs在基因组上定位于与肿瘤相关的脆性位点。MicroRNAs的这些特点决定了它可能成为癌干细胞治疗的特异性靶点。MicroRNAs通过与靶mRNA的3非编码区(3-UTR)不完全互补配对，抑制mRNA翻译或影响mRNA的稳定性，减少蛋白的表达。MicroRNAs能够同时调控上百种目标mRNAs表达，从而调控细胞分化、增殖、凋亡及机体发育。多种MicroRNAs通过沉默癌基因或者抑癌基因的表达，参与癌细胞重要的细胞生物学调控。MicroRNAs的不同也是造成肿瘤干细胞独特生物学特性的重要原因，因此肿瘤干细胞中MicroRNAs表达差异的研究也将为我们以肿瘤干细胞为治疗靶点提供可能。基于此我们进行了如下实验。　　研究目的:　　1.建立体外分离、富集和培养原代乳腺癌干细胞的方法，解决乳腺癌干细胞研究中因干细胞数量少所致的瓶颈问题。　　2.对获得的原代乳腺癌干细胞进行生物学特性研究。　　3.比较原代培养的乳腺癌干细胞和分化细胞之间的差异表达基因，分析乳腺癌干细胞的信号调控通路。　　4.比较原代培养的乳腺癌干细胞和分化细胞之间的差异MicroRNAs，探索乳腺癌干细胞新的治疗靶点。　　研究方法:　　1.采用分子表型不同的四种乳腺癌细胞株进行微球体培养　　采用富含多种细胞因子的无血清培养基对四种不同的乳腺癌细胞(MCF-7，T47D，SKBR3，MDA-MB-231)进行微球体培养，检测不同乳腺癌细胞的微球体形成能力。含血清培养基对微球体进行分化培养。流式细胞仪分析微球体细胞与分化细胞中CD44和CD24分子表达情况。Real-time PCR检测干细胞相关基因表达情况　　2.建立体外分离、富集和培养原代乳腺癌干细胞的方法　　取新鲜乳腺癌患者标本，采用机械及酶消化法制成单细胞悬液，以含多种细胞因子的培养基培养微球体以扩增肿瘤干细胞。含血清的培养基进行分化培养。免疫荧光检测细胞的分化标志和干细胞标志表达情况。Real-time PCR检测干细胞相关基因表达变化。　　3.比较原代培养的微球体和分化细胞之间的差异表达基因　　采用表达谱芯片和MicroRNA芯片检测原代培养的微球体和分化细胞之间的差异表达基因和差异MicroRNAs，分析乳腺癌干细胞的调控机制。　　研究结果:　　1.在富含细胞因子的无血清培养基培养条件下，MCF-7、T47D、SKBR3能够形成微球体，MDA-MB-231不能形成微球体。SKBR3、T47D、MCF-7细胞具有不同的微球体形成能力。在含血清的培养条件下微球体贴壁，细胞迁移，重新获得来源细胞的表型。流式细胞分析显示MCF-7、T47D、SKBR3中几乎不含CD44+细胞，CD24-细胞比例也较低。在微球体细胞中CD24-细胞的比例增加，CD44+细胞的比例无明显变化。　　2.部分原代来源的乳腺癌细胞在无血清条件下能够形成微球体。免疫荧光检测显示，微球体表达干细胞标志OCT4和Nestin，不表达分化细胞标志。在有血清培养环境下，微球体细胞发生分化，并且能够检测到分化相关标志CK14、CK18和α-SMA表达。微球体细胞中干细胞相关基因表达也较分化细胞明显增加。表明微球体培养能够从原代乳腺癌细胞中富集干细胞。　　3.原代培养的乳腺癌微球体干细胞与乳腺癌分化细胞具有不同的基因表达谱及MicroRNAs表达谱。WNT、Hedgehog、MAPK信号通路相关基因表达差异明显。在差异最明显的10个MicroRNAs中hsa-miR-424和hsa-miR-299-5p参与调节大部分差异表达基因，可能成为乳腺癌干细胞治疗的重要靶点。　　结论:　　1.微球体培养方法可以在体外富集、扩增乳腺癌干细胞，这一方法适用于从原代组织中获取乳腺癌干细胞。　　2.乳腺癌干细胞中WNT、Hedgehog、MAPK信号通路相关基因表达差异明显。hsa-miR-424和hsa-miR-299-5p可能成为乳腺癌干细胞治疗的重要靶点。