草地早熟禾(Poa Pratensis L.)是温带地区常用的优质冷季型草坪草种,是已知的抗寒能力最强的草坪草种之一。植物体内存在多条低温信号传递和调控途径,其中,DREB1/CBF调控途径被认为是植物抵御低温的主要途径。DREB1/CBF基因是植物响应低温胁迫的转录激活因子,它通过调控下游基因包括冷应答基因(COR)的表达来提高植物的抗寒能力。本研究从抗寒的草地早熟禾中克隆到一个DREDB1/CBC类基因—通过转化模式植物拟南芥,旨在快速研究该基因在抗寒性中的作用,为改良冷敏感多年生草坪草种的抗寒性奠定基础。本实验主要研究结果如下:(1)从低温处理后的草地早熟禾叶片中分离出一个开放阅读框(ORF)全长为732 bp,编码243个氨基酸的基因。序列分析表明该基因在AP2 DNA结构域的上游和下游分别具有PKK/RPAGRXKFXETRHP和DSAEL这两段DREB1/CBF转录因子的特征序列。根据系统进化树分析,PpCBF3与多年生黑麦草LpCBF3同源性最高,与其他单子叶植物和拟南芥的DREB1/CBF3基因也有很高的同源性,因此我们认为PpCBF3 是一个DREB1/CBF转录因子。(2)瞬时转化拟南芥原生质体实验结果表明,PpCBF3特异地定位于细胞核中,与基因中具有核定位信号(NLS)的结果相符。(3)荧光定量PCR实验和半定量实验表明,PpCBF3基因受低温诱导,低温处理15 min时PoCBF3已响应表达,1h表达量最高,24h后其表达量仍显著高于常温状态。在干旱胁迫和高盐胁迫下,草地早熟禾PpCBF3基因的mRNA相对表达量并无明显改变,因此推测PpCBF3不响应干旱胁迫(20%PEG-6000)和盐胁迫(150mMNaCl)。(4)通过农杆菌侵染法转化拟南芥,通过双丙胺膦(Basta)筛选和PCR鉴定,得到12个阳性转基因株系。对其进行冷冻(-20℃)处理,并根据叶片枯黄率的结果筛选出5个稳定的抗性转基因株系,即line 3,line 6,line 9,line 11和line 12。mRNA相对定量表达分析和western印迹分析表明,转基因株系的PpCBF3都能够在常温下稳定表达。(5)在常温下,转基因拟南芥中DREB1/CBF下游基因COR15a因COR6.6/KIN2,COR47和COR78/RD29a和脯氨酸合成的关键酶基因P5CS的相对表达量都显著高于WT植株。而在低温处理后,尽管WT中这些基因的表达量提高,转基因株系中这些基因的表达量仍然显著高于WT。另外,在冰冻处理后,转基因拟南芥叶片相对电导率,Fv/Fm值和叶绿素含量都显著高于WT;DAB染色和NBT染色结果显示,WT拟南芥在低温胁迫下的H202和O2-含量更高。(6)转基因拟南芥普遍出现开花推迟、矮化或生长延缓等特性,这些特性对多年生草坪草种的基因改良有着极大的意义。综上所述,我们从草地早熟禾中克隆到转录因子PpCBF3,它特异受低温诱导,对干旱胁迫和盐胁迫没有响应。通过转化模式植物拟南芥,初步确定该基因通过对下游基因表达及生理生化的调控,提高植物抗冻性。该研究为培育抗寒草坪草新种质提供重要的基因资源。