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牙龈是牙周组织的天然屏障,不仅对机体状态、口腔环境变化敏感,容易在多种药物使用后产生增生等疾病表型,而且具有强大的损伤后愈合能力,这些现象暗示牙龈组织中可能存在对组织动态平衡和损伤修复具有重要作用的未分化间充质干细胞。近年来多种口腔颌面部组织中都被证明含有间充质干细胞,并表现出相应组织特异干细胞的特性,为利用口腔颌面部间充质干细胞进行疾病干预治疗和组织修复再生奠定了基础。而目前在细胞水平对牙龈生物学的研究集中于牙龈上皮细胞和牙龈固有层成纤维细胞,后者作为一群异质性较强的细胞,虽然有报道其表现出了干细胞特性,但尚无研究针对牙龈固有层中间充质干细胞的身份和功能进行鉴定和分析。本研究采用通常鉴定干细胞的思路和方法进行研究,通过检测原位标志物、体外行为和体内功能等方面的指标,勾勒出牙龈间充质干细胞的身份特征,并揭示其在牙龈增生发生机制和相关免疫疾病治疗方面的潜在作用。所取得的主要研究结果如下:1.增生牙龈组织中固有层较正常牙龈增厚,I型胶原(COL-I)等细胞外基质成分更丰富,高表达Ki-67和增殖细胞核抗原(PCNA)等增殖指标,说明细胞增殖和细胞外基质调节的紊乱与牙龈增生表型密切相关。正常和增生牙龈固有层均存在表达STRO-1和阶段特异性胚胎表面抗原-4(SSEA-4)的细胞,说明牙龈固有层中确实存在具有干细胞表型和功能的细胞群体,在标志蛋白表达上两种组织中干细胞的比例并无差别。2.通过克隆化培养,从正常和增生牙龈组织中获得了贴壁生长的牙龈间充质干细胞。在相同条件下,低密度接种于培养板上的牙龈间充质干细胞产生的克隆数量近似于骨髓间充质干细胞。经过长期扩增后,无论是来自正常牙龈或增生性牙龈的牙龈间充质干细胞均能保持与初始培养时相近的倍增时间,体现出牙龈间充质干细胞具有某种维持细胞周期循环活动的分子机制,促使细胞在增殖刺激原作用下始终具有高反应性。与此相应,牙龈间充质干细胞具有较高的群体倍增值,证明其具有持续增殖的能力。流式细胞学的分析确定了这些细胞在扩增后仍然保持了间充质干细胞的表面标志,表明未分化干细胞的特性并未丧失。3.经过单细胞克隆化培养的牙龈间充质干细胞在成骨诱导后,正常组和增生组均能形成明显的矿化结节,呈现茜素红染色阳性,并表现出较强的骨涎蛋白(BSP)、骨钙素(OCN)、碱性磷酸酶(ALP)等矿化基因的表达。成脂诱导液诱导3 w后,经过油红O染色的牙龈间充质干细胞内部出现红色脂滴,同时表达成脂分化关键基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)和CCAAT增强子结合蛋白α(C/EBPα)。在以细胞团形式接受成软骨诱导后,牙龈间充质干细胞形成类似于软骨细胞的形态和网格状排列,对甲苯胺蓝表现出强阳性染色,表达软骨细胞标志II型胶原A1(COL2A1)和蛋白聚糖(ACAN)。这些结果证明了正常和增生牙龈来源间充质干细胞的多能性。4.免疫细胞化学检测发现基质金属蛋白酶-1(MMP-1)在增生牙龈来源牙龈间充质干细胞中的表达明显低于正常牙龈来源的牙龈间充质干细胞,而两组细胞均阳性表达基质金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1),表达强度无明显差异。将正常和增生牙龈来源间充质干细胞复合纤维蛋白胶植入裸鼠皮下,4周后形成的组织富含长梭形细胞和胶原等细胞外基质,类似于天然的牙龈固有层组织,说明牙龈间充质干细胞具有再生出自身来源组织的能力。同时,增生牙龈来源间充质干细胞在体内植入后表现出了比正常牙龈来源间充质干细胞更强的胶原形成能力。这表明增生组织来源的牙龈间充质干细胞具有重现增生牙龈固有层所具有的大量胶原纤维的能力,可能与调节基质改建的MMP表达变化有关。通过连续移植实验,正常牙龈来源间充质干细胞组未取得移植物,而增生牙龈来源间充质干细胞能继续形成富含基质成分的组织,反映了增生组织来源的牙龈间充质干细胞具有更强的体内自我更新能力。5.通过建立异基因系小鼠间皮肤移植模型,模拟异体抗原诱导的免疫排斥反应,PBS溶液注射组的受体小鼠出现迅速强烈的排斥反应,而注入正常和增生牙龈间充质干细胞组的受体小鼠则延缓了免疫排斥反应的发生速率,表明牙龈间充质干细胞在体内环境中具有十分确定的对免疫排斥反应的抑制作用。大体和组织形态学观察验证了牙龈间充质干细胞对皮肤移植排斥的抑制作用,反映在局部组织炎性细胞浸润较少、组织维持正常的层级结构和细胞成分等方面。混合淋巴细胞反应试验证明上述体系中人牙龈间充质干细胞对小鼠移植皮肤免疫排斥的抑制作用并非通过抑制淋巴细胞增殖实现,而流式细胞学分析证明与正常和增生组织来源牙龈间充质干细胞共培养后的小鼠T淋巴细胞中表达CD4、CD25和FOXP3的调节性T细胞比例明显上升,进一步通过在小鼠皮肤移植前加入抗CD25抗体处理剔除其体内调节性T细胞,观察到外源性牙龈间充质干细胞对免疫排斥反应的抑制作用消失,移植物排斥速度快于对照组,不仅说明调节性T细胞在移植物耐受方面具有关键作用,而且证实其也是外源性牙龈间充质干细胞发挥体内免疫调节功能的重要途径。综上,本研究首次鉴定和分析了正常和增生牙龈组织来源的间充质干细胞,揭示了其在组织再生和免疫调节方面的性能,并且提出了基于干细胞的牙龈增生发生机制,不仅为细胞治疗研究提供了新的来源选择,也为进一步研究牙龈增生的发病机制和干预策略提供了新的策略。