论文部分内容阅读
肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是我国发病率高、预后差、死亡率高的恶性肿瘤之一。虽然检查方法和治疗方法不断提高，但死亡率仍较高，主要原因就是复发和转移。目前提出的肿瘤复发和转移的机制之一就是循环肿瘤细胞（Circulating tumor cell，CTC）的出现。循环肿瘤细胞由肿瘤原发部位或转移部位释放入血，随血液循环到达全身各处，在适宜的地方定居下来，形成转移灶。目前常见的CTC富集方法包括密度梯度离心法、滤膜过滤法、免疫磁珠法等。密度梯度离心法较为简便，但特异性低，得到的CTC纯度较低。免疫磁珠法包括阳性富集法和阴性富集法，虽然特异性高，但比较昂贵。CTC的检测和鉴定方法有免疫细胞化学法、逆转录聚合酶链式反应(Reverse Transcription Polymerase ChainReaction， RT-PCR)法、流式细胞仪法等。目前FDA批准的方法就是CellSearch，主要是应用抗上皮细胞粘附分子（EpCAM）抗体免疫磁珠阳性富集法捕捉CTC，再利用CK和CD45的表达鉴定CTC。但有研究报道，CTC会发生上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT），从而丢失部分上皮性表型，这就使单纯依赖于CTC的上皮性表型的富集和鉴定方法具有一定的假阴性率，同时免疫磁珠阴性富集法比阳性富集法的效率也更高。由于EMT，现存的CTC研究方法不能有效富集和鉴定CTC，都还有待提高；同时CTC也是肿瘤细胞，也存在染色体异常，这是本课题的立足点之一。所以，或许可以利用肿瘤细胞常伴随染色体异常的特征进行联合鉴定。那么，利用密度梯度离心法联合免疫磁珠阴性富集法富集肿瘤细胞，再利用染色体分析技术以及免疫荧光染色技鉴定CTC，或许效率更高。同时虽然关于CTC的研究越来越多，但大部分都是关于乳腺癌、结直肠癌、前列腺癌的，关于HCC的还比较少，这是本课题的立足点之二。基于以上两点，本课题从以下三个方面进行研究：第一部分，探索密度梯度离心法联合免疫磁珠阴性富集法对外周血CTC的富集效率；第二部分，检验染色体荧光原位杂交技术联合免疫荧光染色技术对体外培养的不同肿瘤细胞株的检测效率；第三部分，利用以上的富集和鉴定方法检测HCC患者外周血CTC。第一部分：密度梯度离心联合免疫磁珠阴性富集循环肿瘤细胞方法的建立利用绿色荧光线粒体探针标记结肠癌细胞株SW480，然后计数，将一定量的肿瘤细胞打入健康人外周血，再利用密度梯度离心法联合免疫磁珠阴性富集法富集肿瘤细胞，最后计算回收率。结果表明，利用密度梯度离心法和免疫磁珠阴性富集法能够高效回收外周血中的肿瘤细胞，回收效率较高，则认为该方法的富集效率较高，可用于外周血CTC的富集。第二部分：染色体荧光原位杂交技术联合基于细胞表面标志物的免疫荧光反应的肿瘤细胞鉴定方法的建立选用8株细胞株：乳腺癌细胞株MDA-MB-231、膀胱癌细胞株scaber、卵巢癌细胞株SK-OV-3、肾癌细胞株TK10、肝癌细胞株HepG2、肺癌细胞株A549、结肠癌细胞株SW480、胃癌细胞株SNU-16。首先，我们将体外培养的前四株肿瘤细胞株细胞直接涂片于载玻片上，然后利用染色体荧光原位杂交技术（chromosomefluorescence in situ hybridization，FISH）联合免疫荧光染色技术鉴定肿瘤细胞。接着，我们将体外培养的后面四株肿瘤细胞株细胞混入外周血，然后利用密度梯度离心法和免疫磁珠阴性富集法富集肿瘤细胞。再利用上述方法进行鉴定。实验结果都表明，染色体荧光原位杂交技术联合免疫荧光染色技术能够高效鉴定出多种肿瘤细胞株的细胞，可用于临床多种实体肿瘤患者外周血CTC的鉴定。第三部分：应用密度梯度离心联合免疫磁珠阴性富集法和染色体原位杂交联合免疫荧光染色鉴定法检测肝细胞癌患者外周血循环肿瘤细胞及其临床意义我们入组HCC患者35例，利用密度梯度离心法联合免疫磁珠阴性富集法富集CTC，然后利用染色体荧光原位杂交技术联合免疫荧光染色技术鉴定肿瘤细胞。结果表明，HCC患者外周血中的CTC与肿瘤有无血管癌栓和患者的预后没有明显的关系，但与患者有无淋巴结和/或远处转移有关，HCC患者外周血CTC的数量≥5个时可能肿瘤更容易出现淋巴节和/或远处转移；对于III期和IV期的患者而言，CTC的数量与肿瘤分期亦无明显关联。综上所述，我们的研究结果提示以下结论：1.成功建立高效检测适用于肝细胞癌在内的循环肿瘤细胞的方法。2. HCC患者外周血中的CTC数量与肿瘤有无淋巴结和/或远处转移有关，CTC的数量≥5个时可能肿瘤更容易出现淋巴节和/或远处转移。