研究背景及目的:革兰阳性或革兰阴性细菌、病毒等病原微生物感染机体时,这些病原微生物释放LPS、肽聚糖(peptidoglycan,PGN)等活性成分,与炎症反应细胞的表面受体模式识别并结合,引起一系列胞内信号事件和效应分子的级联释放,介导脓毒症的发生发展。脂多糖/内毒素(endotoxin/lipopolysaccharide,LPS)是介导脓毒症发生最常见的致病因子,由类脂A、核心多糖和O-抗原三部分共价连接而成。LPS与其模式识别受体TLR4(toll-like receptor 4)结合,沿着MyD88依赖及TRAM-TRIF依赖两条途径启动细胞内信号转导,活化NF-κB(nuclear factor kappa B)和IRF-3(interferon regulatory factor 3),导致肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)、白介素-6(interleukin-6,IL-6)、趋化因子等多种效应分子的合成和释放。4-氨基喹啉类抗疟药氯喹(chloroquine,CQ),是一种弱碱性药物,抑制内体和溶酶体的酸化成熟。本课题组早前发现,CQ显著提高脓毒症小鼠的总体生存率,负调控LPS刺激人外周血单个核细胞(human peripheral blood mononuclear cell,hPBMC)和小鼠巨噬细胞(ANA-1)上清中TNF-α和IL-6的释放。且其他研究同样证实CQ具有较广谱的抗炎活性,如CQ提高多种微生物混合感染所致脓毒症小鼠的总体生存率、减轻肾功能损伤和脾细胞凋亡。因此,本课题组从04年开始进行CQ抗炎的相关研究,并在前期大量工作中发现CQ抑制LPS介导单核/巨噬细胞的活化、影响LPS-TLR4复合物的内化和解离、影响细胞膜表面受体TLR4的表达等。此外,我们还发现,CQ上调小泛素相关修饰物特异性蛋白酶(SUMO-specific protease 6,SENP6)的蛋白表达,减少TNF-α、IL-6、IFN-γ等炎症介质的释放。SUMO是类泛素分子,酶催化下共轭结合在底物蛋白赖氨酸残基上的过程称为SUMO化(SUMOylation),是一种蛋白质翻译后修饰,调节蛋白质的亚细胞定位和空间结构,参与NF-κB通路和STAT信号调控。SUMO是酶催化的可逆反应,因此SUMO在泛素样修饰物蛋白酶(ubiquitin-like modifier protease,ULP)/去SUMO化酶催化下可从底物蛋白的赖氨酸残基上解离。SENP6是一种去SUMO化酶,介导IRF3或IRF7的去SUMO化负反馈抑制IFN的转录。我们研究发现CQ上调SENP6的蛋白表达,后者诱导NF-κB的去SUMO化,下调TNF-α、IFN-γ等炎症介质的释放。SUMO和泛素分子结构有高度的同源性,SUMO化和泛素化修饰过程相仿,虽然SUMO化和泛素化的修饰位点存在相互竞争,CQ可上调去SUMO化酶SENP6直接作用于NF-κB调节LPS诱导巨噬细胞活化,那么进行同向类比,CQ是否也可以上调去泛素化酶的表达作用于NF-κB之外的其他信号分子调控LPS-TLR4通路?泛素(ubiquitin)是由76个氨基酸组成的小分子蛋白,在E1、E2、E3的顺序作用下连接到底物蛋白赖氨酸残基,发挥不同的生物学功能。泛素和E1、E2、E3及26S蛋白酶体组成泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system,UPS),作为真核细胞中主要溶酶体非依赖的蛋白降解途径,参与炎症、信号转导、细胞凋亡等多种生物学活动。泛素在不同E2和E3的催化下通过其分子结构中存在的蛋氨酸和赖氨酸残基形成8种不同拓扑结构和功能的多聚泛素链,这个过程叫泛素化。泛素化是酶催化的可逆反应,去泛素化酶(deubiquitinases,DUBs)催化靶蛋白上连接的多聚泛素链与底物蛋白的解离。人基因组约编码五大类DUB,N末端卵巢癌型蛋白酶(ovarian tumor-type proteases,OTU)、泛素C末端水解酶(ubiquitin C-terminal hydrolases,UCH)、泛素特异性蛋白酶(ubiquitin-specific proteases,USP)、马查多-约瑟夫病蛋白酶(Machado-Joseph disease proteases,MJD)和金属蛋白酶(metalloproteases),其中研究较多的是USP家族和OTU家族去泛素化酶。细胞表面受体的内化和转运同样参与细胞内信号转导,LPS与TLR4结合,内化进入早期内体,逐渐酸化成熟形成晚期内体并与溶酶体融合,在早期内体-晚期内体-溶酶体动态变化过程中,早期内体含有特殊的小半鞘,其中包含转运所需内体分选复合物(endosomal sorting complex required for transport,ESCRT),由ESCRT分选出的泛素化标记的膜蛋白转运至溶酶体降解。有研究证实,E3或DUB与ESCRT的相互作用调节表面受体的内化和转运,调控细胞内信号转导。溶酶体主要参与内化物质的分解代谢和再循环,蛋白酶体则主要参与功能或结构异常蛋白的降解。既已证实CQ有较广谱的抗炎活性,且本课题组前期研究发现,CQ预处理Raw264.7细胞中LPS与TLR4共定位现象消失,且细胞膜表面TLR4受体表达减少;我们考虑CQ是酸化抑制剂,抑制内体和溶酶体酸化成熟,似乎CQ促进LPS-TLR4解离、降低膜表面受体TLR4的表达与溶酶体关联不大。因此我们进一步猜想CQ是否通过泛素-蛋白酶体途径增加LPS-TLR4的分离与降解而参与抑制LPS诱导巨噬细胞活化的?综上所述,本课题从CQ抑制LPS诱导巨噬细胞活化的研究切入,藉由泛素-蛋白酶体途径阻断对不同炎症介质释放的效应入手,阐述CQ负调控LPS-TLR4通路可能的分子机制。因此,本课题先筛选CQ对不同DUB分子mRNA表达的影响,进一步探讨锌指蛋白A20和泛素特异性蛋白酶USP25通过影响信号通路中间分子的活性,影响TLR4介导下游信号通路的活化和炎症介质释放的可能机制。研究方法:1.CQ影响OTU和USP家族去泛素化酶mRNA表达的筛选研究:20ug/ml终浓度CQ预处理Raw264.7细胞1h,加100ng/ml浓度的LPS刺激2h;荧光定量PCR检测DUBs的mRNA表达。2.锌指蛋白A20调控CQ抑制LPS-TLR4通路的机制研究:2.1 CQ对Raw264.7细胞A20表达水平的影响:用不同浓度(0、5、10、20ug/ml)CQ预处理Raw264.7细胞24h,A20的mRNA和蛋白表达水平以PCR和western blot(WB)法分别检测CQ对A20表达的剂量-效应关系;并以达到A20最大表达水平的剂量预处理Raw264.7细胞1h,LPS刺激4h确定CQ对LPS活化Raw264.7细胞中A20的mRNA和蛋白表达水平。2.2 siRNA沉默A20表达变化导致的LPS-TLR4通路的影响:(1)siRNA转染技术将公司设计合成的3条siRNA转染Raw264.7细胞24-48h,A20的基因及蛋白水平分别用PCR和WB评估不同的干扰表达效果,选择干扰效果最优的siRNA建立干扰模型;(2)siRNA干扰A20表达,CQ预处理1h,LPS刺激4h,RT-PCR检测TNF-α和IL-6的mRNA表达;WB检测MAPK p38及其磷酸化水平;(3)siRNA干扰A20,CQ预处理1h,LPS刺激1h,激光共聚焦检测NF-κB和IRF3的核转位情况。3.泛素特异性蛋白酶USP25调控CQ抑制LPS诱导巨噬细胞活化的机制研究:3.1 CQ影响Raw264.7细胞USP25表达情况:梯度剂量(0、5、10、20ug/ml)CQ预处理小鼠Raw264.7细胞或人THP-1细胞24h,PCR和WB分别检测USP25的mRNA和蛋白表达的剂量-效应关系;并以最大表达剂量的CQ预处理Raw264.7细胞1h,LPS刺激4h确定CQ对LPS活化Raw264.7细胞中USP25的mRNA和蛋白表达水平。3.2 siRNA干扰USP25表达对CQ抑制LPS诱导巨噬细胞活化的影响:(1)siRNA转染Raw264.7细胞24-48h,PCR和WB评估mRNA和蛋白水平干扰表达效果,建立干扰模型;(2)siRNA干扰USP25表达,CQ预处理1h,LPS刺激4h,RT-PCR检测TNF-α、IL-6和IFN-β的mRNA表达;WB检测TLR4下游信号分子IκB、NF-κB和MAPKs通路分子p38、ERK、JNK及其磷酸化水平;(3)si RNA干扰USP25表达,CQ预处理1h,LPS刺激24h,ELISA检测TNF-α、IL-6和IFN-β的释放水平;(4)siRNA干扰USP25表达,CQ预处理1h,LPS刺激4h或12h,ELISA检测NF-κB亚基p65和p50的活化情况;(5)siRNA干扰USP25,CQ预处理1h,LPS刺激1h,激光共聚焦检测NF-κB和IRF3转位入核变化;4.A20和USP25调控CQ抑制LPS诱导巨噬细胞活化的相互作用研究:(1)siRNA共转染双干扰A20和USP25,CQ预处理1h,LPS刺激24h,ELISA检测上清中TNF-α、IL-6和IFN-β的释放水平;(2)siRNA共转染双干扰A20和USP25,CQ预处理1h,LPS刺激4h,WB检测MAPK p38及其磷酸化水平;(3)siRNA共转染双干扰A20和USP25,CQ预处理1h,LPS刺激1h,激光共聚焦检测NF-κB和IRF3入核情况。5.统计学分析:计量资料以均值±标准差(X±S)表示,应用SPSS 13.0统计软件,采用单因素方差分析进行统计处理,以p<0.05为差异有统计学意义。研究结果:1.CQ影响OTU和USP家族去泛素化酶mRNA表达的筛选研究:PCR结果显示,CQ显著上调OTU家族去泛素化酶A20和OTULIN的mRNA表达;CQ上调USP家族去泛素化酶CYLD、USP2、USP3、USP4、USP7、USP8、USP25和USP28的mRNA表达。2.锌指蛋白A20调控CQ抑制LPS-TLR4通路的机制研究(1)A20的mRNA和蛋白表达与CQ存在正向剂量-效应关系,且A20的mRNA和蛋白表达在CQ预处理LPS刺激Raw264.7细胞中显著增加;(2)PCR和WB检测3条公司设计合成的siRNA序列发现siRNA1干扰效果最明显,因此以siRNA1建立干扰模型并应用在后续效应实验中;(3)A20干扰表达,TNF-α和IL-6的mRNA表达显著增加,p38磷酸化水平显著上调,且NF-κB p65和IRF3的转位入核明显增加。3.泛素特异性蛋白酶USP25调控CQ抑制LPS诱导巨噬细胞活化的机制研究(1)USP25的mRNA和蛋白表达与CQ存在正向剂量-效应关系,且在CQ预处理LPS刺激Raw264.7细胞中USP25的mRNA和蛋白表达也增加;(2)PCR和WB检测siRNA干扰mRNA和蛋白表达情况,成功建立干扰模型并应用在后续实验中;(3)USP25干扰表达,PCR结果显示,TNF-α、IL-6和IFN-β的mRNA表达明显增加;ELISA结果显示,上清中TNF-α、IL-6和IFN-β释放增加;WB结果显示,MAPK通路p38、ERK和JNK磷酸化水平明显上调,IκB降解增加,p-IκB磷酸化增加,NF-κB磷酸化也增加;NF-κB ELISA结果显示,NF-κB亚基p65和p50早期和晚期活化水平均明显增加;共聚焦结果显示,NF-κB和IRF3转位入核明显增加。4.A20和USP25调控CQ抑制LPS诱导巨噬细胞活化的相互作用研究:A20和USP25双干扰,ELISA结果显示,TNF-α和IL-6的释放减少,而IFN-β的释放增加;WB结果显示,p38磷酸化减少;共聚焦结果显示,NF-κB p65入核减少,而IRF3入核未见明显减少。研究结论:1.确定CQ预处理对DUB分子mRNA表达的调节作用,CQ上调多数USPs、A20及CYLD的mRNA表达。2.CQ预处理A20和USP25的表达上调可能改变LPS-TLR4通路中NF-κB外其他信号分子的生物学活性,进而影响NF-κB的活化和炎症介质的释放。A20或USP25干扰表达均会造成CQ抑制LPS-TLR4通路效应的阻断;但A20和USP25干扰表达CQ抑制NF-κB和MAPK通路的活化增加,抑制IRF通路的活化减弱,提示A20和USP25可能在LPS诱导MyD88和TRAM-TRIF两条信号通路中的存在不同和复杂的相互作用。3.CQ抑制LPS诱导巨噬细胞活化与泛素-蛋白酶体系统存在一定的关联,但泛素-蛋白酶体系统组成众多,调控精密复杂,因此CQ对LPS-TLR4通路的抑制作用可能需要多个DUBs的协同作用,从多方面多途径发挥其炎症抑制效应。