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血糖升高是糖尿病的主要特点之一。动脉粥样硬化是糖尿病的严重并发症,氧化应激在此过程中起重要作用。氧化应激是指体内活性氧(reactive oxygen species, ROS)产生过多超过了机体自身的清除能力从而在体内蓄积导致机体损伤。机体内产生ROS主要有以下五种途径:黄嘌呤氧化酶、NADPH氧化酶(nicotinamide vadenine dinucleotide phosphate oxidase,NOX)、线粒体电子传递链、一氧化氮合酶及脂氧合酶,其中NOX可能是血管内皮细胞中ROS的主要来源。吞噬型NADPH氧化酶是由多个亚基组成的酶复合体,主要包括胞膜组分:细胞色素b558(gp91phox和p22phox)和胞浆组分:p47phox、p67phox及Rac(小的GTP结合蛋白)共五个亚组分。gp91phox(有NADPH、heme、FAD的潜在结合位点)和p22phox是NOX的酶促核心,它们受p47phox及Rac的调节。近几年在对各种组织的研究中发现NOX有5种同源家族体,分别称为NOX1、NOX2(gp91phox)、NOX3、NOX4和NOX5,血管内皮细胞主要表达其中的NOX2和NOX4,且NOX4表达水平比NOX2高约20倍。进一步的研究显示,血管内皮细胞产生的ROS主要来源于NOX4。我们的研究表明,高浓度葡萄糖能够通过上调人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)中NOX4的表达,引起ROS升高,而NOX抑制剂能够抑制葡萄糖的这种作用。在此基础上,我们进一步对NOX的信号调节机制进行了探讨。目的探讨高糖处理HUVECs时ROS水平的改变及其主要生成途径,观察NOX亚组分表达的变化并研究NOX的调节机制。方法用Ⅱ型胶原酶消化分离培养HUVECs,在倒置显微镜下观察其形态。免疫荧光法检测HUVECs内第Ⅷ因子相关抗原的表达;RT-PCR、Real-time PCR和western blot分析NOX及其亚单位表达的变化;流式细胞仪检测细胞内ROS的水平;免疫荧光法观察NOX亚组分p47phox的细胞内定位。结果分离得到的HUVECs均表达第Ⅷ因子相关抗原;高糖处理HUVECs后细胞内ROS升高、NOX4表达明显上调;NOX抑制剂DPI能够抑制NOX4表达的上调和细胞内ROS的升高;在ROS产生过程中p47phox向核膜移位,Apocynin(p47phox抑制剂)能够抑制p47phox的核膜移位、ROS的升高及NOX4的上调;PMA(PKC激动剂)通过促进p47phox向核膜移位诱导ROS的产生,Hyperinin(PKC抑制剂)能抑制这种作用。结论高糖处理HUVECs时细胞内ROS升高主要来源于NADPH氧化酶;高糖上调HUVECs内NOX4表达;高糖通过PKC信号通路调节p47phox向核膜移位从而促进ROS的产生。