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马立克氏病(Marek’s Disease，MD)是由马立克氏病病毒(Marek’s Disease Virus，MDV)引起的鸡的一种高度传染性，淋巴组织增生性疾病。自上世纪70年代，通过接种MDV非致瘤株或火鸡疱疹病毒(HVT)活疫苗以来，MD得到了很好的控制，当前，预防接种仍是控制该病的主要手段。但马立克氏病病毒毒力不断增强，降低了疫苗的免疫保护效果。50年代，温和MDV转变为强毒MDV(vMDV)，70年代，从vMDV转变为超强毒MDV(vvMDV)，90年代早期，出现超超强毒致病型(vv+MDV)，该致病型病毒的出现导致溶细胞活性增强，不同寻常的器官嗜性，而且免疫抑制和T淋巴细胞转化为肿瘤细胞能力增强并引起宿主早期死亡，给养禽业带来了更大的损失，养鸡业迫切需要更有效的MD疫苗。随着分子生物学的广泛使用，人们一直很看好MD基因重组疫苗的前景，MDV疫苗株被认为是最有潜力的病毒载体之一，通过构建表达外源基因抗原的多价活疫苗达到预防禽病的目的。本文利用MDV1疫苗株CVI988作为载体表达绿色荧光蛋白以及不同血清型MDV主要保护抗原基因的抗原表位，构建了几株重组病毒，分别并检测它们对SPF鸡抵抗超强马立克氏病病毒(vvMDV)攻击的免疫保护作用。研究主要从以下几个方面展开： 1．表达GFP的重组CVI988病毒的构建及其在体内外的生长状态 提取马立克氏病病毒Ⅰ型疫苗毒株CVI988／Rispens的总DNA为模板，利用PCR技术扩增出病毒生长非必需区US2基因，克隆入T-easy载体。将CMV启动子控制的含GFP基因表达盒克隆入US2基因中，成功构建了含GFP基因的转移质粒载体pGUS2GFP。用脂质体将其与CVI988株共转染CEF细胞，用96孔板稀释法得到纯化的表达绿色荧光蛋白的重组CVI988病毒株rCVIGFP，并分别测定其在体内和体外的生长情况。表达EGFP基因的重组病毒在细胞上生长曲线与亲本毒CVI988类似，从观察重组病毒在感染细胞上的蚀斑数(PFU)来看，重组病毒在接种细胞后第5天的蚀斑数最高，随后则出现下降趋势。体内实验表明，1日龄腹腔接种该重组毒后，可以从鸡体内分离到表达绿色荧光的病毒。该重组病毒的获得，证实以CVI988病毒作为病毒载体在短独特区插入外源基因构建的重组病毒具有较好的稳定性，为探讨构建MD重组病毒疫苗奠定基础。 2．表达HVTgB主要抗原表位的重组CVI988病毒的构建 据报道，CVI988与HVT联合使用可以提高鸡群对MDV的免疫保护作用，同时有研张雪莲表达血清l、3型MDvgB主要抗原表位基因的重组cvI988病毒构建及其免疫保护作用究表明，MDV生长非必需区USIO基因是插入表达外源基因的最稳定区，且不会影响疫苗的免疫原性，因此我们选择HVTgB基因主要抗原表位作为靶基因，通过插入US10基因中构建CVI988重组病毒。扩增CVI988株MDV包括部分s。rfZ和sorf3基因及全部USI和US10基因约2.skb，构建包含重组臂基因的重组载体pBUS10。通过引物中添加外源短片段序列的方法，在火鸡疤疹病毒(HVT)gB基因主要抗原表位的前端及后端分别加上血凝素基因Tag(HA)及终止子TAA，并克隆到已构建好的质粒载体PIREgPtB多克隆位点，构建出在CMv启动子和增强子控制下包含gPt基因和gB3基因主要杭原表位的双顺反子基因表达盒。对含HA Tag和gB3主要抗原表位的融合片段进行测序，结果表明:目的片段中含有HA序列和gB3主要杭原表位基因，且两者融合后阅读框不变，基因序列与设计完全一致，未发生碱基的突变。将双顺反子基因表达盒插入重组臂载体paUS10质粒的US10基因中，获得转移质粒载体pBUSzogptgB3。该载体转染CHO细胞，用杭HvT的多抗与之反应，同时采取兔抗鸡工gY荧光二杭进行间接免疫荧光试验(IFA)，结果证实该转移质粒载体可有效地表达HVTgB基因。转移质粒载体转染已感染CVI988病毒的CEF细胞，在细胞培养液中存在霉酚酸一次黄噪吟一HAT(MXHAT)的条件下筛选出表达gpt和gB3基因的重组病毒::CVIUS10一g一gB3。对重组病毒在选择性培养基和正常培养基中生长滴度以及重组毒与亲本病毒在细胞上形成的病变大小比较表明:重组病毒的生物学特性没有因插入外源基因而发生改变。利用HA单克隆抗体进行IFA检测，结果显示该重组病毒可有效表达插入的外源基因。3.串联表达血清1型MDvgB主要抗原表位的重组CVI988病毒的构建 比较MDV三种血清型糖蛋白B的抗原性，选择编码血清1型GA株病毒糖蛋白B主要抗原表位2 50一460位氨基酸的核普酸序列作为目的基因，将该基因通过一个9个氛基酸(GSLAGALGL)的1 inker在SK(+)载体中重复串联一次，并对该串联片段测序结果进行分析，单个片段主要位于gBI基因的7 50一1 380 nt，将串联片段的基因序列转换为氨基酸和两片段之间的L 1 nker，转换成氨基酸后，经DNASta:生物学软件分析表明:此片段的杭原性较强，且富含a螺旋，p一折叠及转角，亲水区与疏水区交替出现，该Linker编码的9个氨基酸，是由丙氨酸、甘氨酸和亮氛酸组成，因为这三种氨基酸是结构比较简单的疏水性氨基酸，通过杭原性和结构分析，它几乎没有任何抗原性，对整个蛋白的结构和免疫原性不会产生影响，且由于这几种氨基酸的柔韧胜较好，对维持表达蛋白的空间结构有?