产微囊藻毒素藻株的PCR检测方法的研究

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水华蓝藻可以产生许多各种不同的毒素(蓝藻毒素),其中发生最频繁、危害最大的是一种肝毒素:微囊藻毒素(MC)。淡水中,微囊藻毒素(MC)主要是由微囊藻、鱼腥藻和浮丝藻产生的。蓝藻毒素的检测是研究蓝藻水华的重要方面,快速有效的检测方法对于判断湖泊水质好坏、建立水华预警系统、提出合理的治理方法均有重大意义。  蓝藻水华发生时,有毒蓝藻和无毒蓝藻同时发生,不能在常规的显微镜下进行区分。基于微囊藻毒素合成酶基因(mcy)的分子生物学方法能够对潜在的产毒蓝藻进行检测。MCs是由微囊藻毒素合成酶基因(mcy)编码的非核糖体酶复合物产生的,mcy已经在产MC的种类中被标记。生物合成基因的存在已经被证明是MC产生的先决条件。铜绿微囊藻的mcy基因簇包括嵌入在两个双向转录操纵子中的10个基因:mcyA、mcyB、mcyC、mcyD、mcyE、mcyF、mcyG、mcyH、mcyI和mcyJ。  本文针对微囊藻毒素主要合成酶基因mcyA、mcyB、mcyC、mcyD、mcyE和mcyG基因设计了7对检测引物,其中,针对mcyG基因设计了2对引物。同时针对蓝藻藻蓝蛋白保守基因序列和微囊藻16srRNA保守基因序列设计了两对对照引物,来对照蓝藻和微囊藻的存在。通过对16种蓝藻的PCR检测,结果显示6种蓝藻基因组对6对检测引物的PCR反应均显示阳性。通过高效液相色谱(HPLC)检测相对比,其结果基本一致。  通过优化PCR扩增条件,成功对mcyA保守基因序列引物和藻蓝蛋白保守基因序列引物两对引物进行双重 PCR,可以在同一组PCR反应数据中看到藻蓝蛋白基因和mcyA保守基因序列的存在。这为以后同时检测野外水样中蓝藻细胞总量和产微囊藻毒素蓝藻细胞的总量的定性和定量检测打下基础。鉴于产微囊藻毒素微囊藻种类偏多的道理,在双重PCR的基础上,加入微囊藻16srRNA保守基因序列引物,对应条带用来指示微囊藻细胞的含量,成功设计三重PCR。  为了更简便的检测水中微囊藻毒素的存在,采取超声波破碎的方法对藻液进行简单前处理,进行全细胞PCR,得到了与使用基因组PCR检测一致的结果。  试验中,在PCR反应体系中加入B11和B12碳管纳米材料,结果初步验证B11纳米材料对PCR扩增具有增效作用。  以上研究结果为野外水华水样的检测奠定了基础。
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