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背景与目的:新型冠状病毒（severe acute respiratory syndrome corona virus 2,SARS-CoV-2）是一种于2019年底出现的高传染性和高致病性冠状病毒。新冠病毒感染的典型临床特征包括弥漫性肺泡出血和渗出性肺炎,淋巴细胞减少,进一步发展为急性呼吸窘迫综合征（ARDS）,全身炎症反应性综合征（SIRS）,血栓形成和栓塞、休克,最终导致包括肺损伤在内的多器官功能障碍和弥散性血管内凝血综合征（DIC）样综合征。大量研究显示新冠病毒导致的全身性炎症反应综合征和多器官衰竭并不是由SARS-CoV-2的入侵和复制所直接导致,而是在多种因素的共同作用下诱导的细胞死亡和免疫炎症反应所驱动的。新冠病毒的包膜蛋白（E蛋白）是构成病毒颗粒的一种结构蛋白,它定位在病毒颗粒的外壳上。研究显示SARS病毒E蛋白可在体外模型中引发细胞凋亡,并且在小鼠模型中引发炎症反应和肺损伤。基因序列比对表明SARS-CoV-2和SARS病毒的E蛋白高度保守,提示它们在功能上可能具有相似性。因此本课题拟利用体内外模型来探究SARS-CoV-2 E蛋白对细胞死亡和小鼠脏器损伤的作用,在此基础上探讨E蛋白诱导单核细胞死亡的分子机制,同时对靶向E蛋白诱导的单核细胞死亡的保护剂进行筛选和活性研究,以期为COVID-19的潜在靶点筛选和临床药物开发提供新的见解和思路。实验方法:1.SARS-CoV-2 E蛋白引起细胞死亡和多脏器损伤的作用:1)通过小鼠尾静脉注射E蛋白（20μg/kg）构建动物病理模型,收集血清和组织样本进行血清乳酸脱氢酶（LDH）检测和组织病理分析;2)体外培养人外周血单核细胞（THP-1）,人脐静脉内皮细胞（HUVECs）和人支气管上皮细胞（BEAS-2B）,采用不同浓度的E蛋白作用以上细胞,或用相同浓度的E蛋白作用细胞不同时长,通过CCK-8和LDH漏出率检测E蛋白对细胞的毒性作用;3)用不同SARS-CoV-2的结构蛋白和非结构蛋白分别处理THP-1细胞,通过CCK-8和LDH漏出率检测不同蛋白的细胞毒性作用。2.SARS-CoV-2 E蛋白诱导单核细胞焦亡的作用和机制分析:1)利用不同的死亡抑制剂预处理THP-1,CCK-8和LDH漏出率检测细胞毒性,Annexin V/PI染色和光学显微镜观察细胞形态学变化,分析E蛋白诱导的细胞死亡的可能形式;2)通过Western blot检测E蛋白刺激后THP-1细胞中NLRP3/GSDMD经典焦亡信号以及NF-κB和MAPK促炎信号通路激活情况;3)实时荧光定量PCR（QPCR）分析促炎细胞因子表达;4)利用NF-κB抑制剂和TLR2抑制剂预处理THP-1,CCK-8和LDH漏出率检测细胞毒性,证实E蛋白通过TLR2/NF-κB信号诱导单核细胞焦亡。3.Ruscogenin对SARS-CoV-2 E蛋白诱导的单核细胞焦亡的保护作用和机制分析:1)通过CCK-8和LDH漏出率检测,筛选出对E蛋白诱导的细胞死亡具有保护作用的小分子化合物;2)利用不同浓度的Ruscogenin预作用THP-1,通过CCK-8,LDH漏出率和形态学观察,分析Ruscogenin对E蛋白诱导单核细胞焦亡的保护作用的量效反应;3)通过Western blot检测Ruscogenin对NLRP3/GSDMD焦亡途径和促炎信号通路激活情况的影响。实验结果:1.静脉注射SARS-CoV-2 E蛋白可导致小鼠血清中LDH水平显著升高,肺和肝脏组织出现明显的病理损伤和炎性浸润。外源性给予SARS-CoV-2 E蛋白可时间和剂量依赖诱导THP-1,HUVECs和BEAS-2B发生细胞死亡。在THP-1细胞中,SARS-CoV-2的S,N,NSP1,NSP3,NSP5,NSP7,NSP8蛋白不能诱导细胞死亡,仅E蛋白可以特异性诱导THP-1细胞死亡。2.SARS-CoV-2 E蛋白处理可以诱导THP-1发生细胞肿胀的典型焦亡样死亡,并时间和剂量依赖地引发NLRP3表达升高和焦亡相关蛋白GSDMD的活化;此外E蛋白可以诱导NF-κB,p38和JNK促炎信号的激活,并增加NLRP3和TNF-α,IL-1α,IL-1β,IL-6,CCL-5等促炎细胞因子的基因表达;而泛caspase,TLR2和NF-κB抑制剂可部分抑制E蛋白诱导的THP-1死亡。3.通过筛选发现天然产物Ruscogenin可以剂量依赖地减轻E蛋白诱导的THP-1焦亡样死亡,减少NLRP3表达以及下游Caspase-1和GSDMD的活化;Ruscogenin可以抑制促炎信号NF-κB的激活,而不影响p38和JNK信号。实验结论:1.在整体动物水平,SARS-CoV-2 E蛋白可以诱导小鼠组织损伤和炎性浸润;体外模型中,E蛋白可诱导多种细胞发生死亡,提示E蛋白可能作为一种毒力因子参与新冠肺炎导致的组织损伤。;2.SARS-CoV-2 E蛋白可能部分通过TLR2/NF-κB,p38和JNK信号通路,激活NLRP3/GSDMD途径,诱导单核细胞焦亡。3.Ruscogenin可能通过抑制NF-κB信号通路,阻止NLRP3/GSDMD激活,从而减轻SARS-CoV-2 E蛋白导致的单核细胞焦亡。