论文部分内容阅读
生长激素(growth hormone,GH)是所有脊椎动物包括鱼类维持正常的生长和发育所必需的一种单链多肽激素,在机体的生长和发育过程中起着重要作用。具有促进脂类降解,加速蛋白合成等作用。天然鱼体中GH含量低,许多研究证实,重组生长激素具有天然生长激素的功能,因此,为了得到大量具有生物活性的重组生长激素,本论文成功将泥鳅生长激素基因(Misgurnus Anguillicaudatus GH,MaGH)克隆入pPIC9K表达载体,并实现在毕赤酵母(Pichiapastoris)的分泌表达。
以成体泥鳅脑垂体中提取的总RNA为模板,用RT-PCR方法扩增并克隆cDNA,根据MaGH两端序列改造,设计一对特异性引物(上游引物加入EcoRⅠ酶切位点,下游引物加入NotⅠ酶切位点)扩增了泥鳅的GH成熟肽cDNA。将获得的泥鳅生长激素基因表达片段,经酶切后连接到能够获得高拷贝数,并含有酵母相应信号肽的pPIC9K表达载体中,转化大肠杆菌DH5α,获得重组pPIC9K-MaGH酵母高效表达载体。用质粒PCR方法筛选阳性克隆,用EcoRⅠ和NotⅠ酶切鉴定重组质粒。测序表明MaGH正确插入α分泌信号开放读码框的下游。再将获得的pPIC9K-MaGH重组子线性化处理,经氯化锂转化组氨酸缺陷型毕赤巴斯德酵母GS115,转化后的酵母菌株经MD培养基筛选阳性重组子,提取转化子基因组DNA,用基因组PCR鉴定重组菌株。将这些克隆用诱导表达培养基BMMY诱导,取上清进行SDS-PAGE分析,结果表明,在上清中检测到MaGH,诱导4天时表达量最高,占上清总蛋白的53%,最高表达量为300mg/L。不同的pH值实验表明,最适pH值为6.0。将重组工程菌投喂泥鳅鱼苗,实验鱼的体重和体长明显高于对照组,达到显著性差异,实验初步显示分泌表达的MaGH具有促进泥鳅生长作用。
本研究克隆到了泥鳅GH基因成熟肽的cDNA序列,并成功构建了真核表达载体,实现了泥鳅重组GH蛋白的高效表达,为进一步开展其应用和生物活性检测分析及研制新型鱼类生长饲料促进剂奠定基础。也为下一步进行产物纯化及其物学功能研究奠定了基础。