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目的:本课题拟基于miR-182前期临床研究结果,miR-182在晚期NSCLC患者血清中的表达明显低于健康志愿者,在治疗获益的益气除痰方干预组的晚期NSCLC患者血清中则表达增高。基于miR-182探讨益气除痰方干预NSCLC自噬和凋亡的分子机制和作用靶点。方法:第一部分:miR-182调控自噬和凋亡（1）运用实时荧光定量PCR检测,比较非小细胞肺癌A549细胞系转染miR-182-5p mimic、对照组中miR-182-5p的相对表达情况;Western-blot免疫印迹检测,检测不同转染浓度的miR-182-5p mimic对自噬相关基因蛋白ATG7表达的影响。（2）通过增殖（Edu）、凋亡（Tunel）实验,评估miR-182-5p mimic、miR-182-5p inhibitor干预48h后,对A549、95D、95C细胞增殖、凋亡的影响。（3）通过细胞免疫荧光实验,评估miR-182-5p mimic、miR-182-5p inhibitor干预48h后,对A549、95D、95C细胞miR-182-5p/ATG7自噬通路、Bcl-2家族与内在凋亡诱导通路的影响。第二部分:基于miR-182探讨益气除痰方干预NSCLC自噬和凋亡机制研究（1）运用CCK-8法检测益气除痰方、miR-182 mimics、miR-182 inhibitor,在非小细胞肺癌细胞系上,对细胞活力以及耐药性的影响。（2）通过Ed U、TUNEL实验,考察益气除痰方、miR-182 mimics、miR-182 inhibitor在A549、95D、95C细胞系上,对细胞增殖以及凋亡的影响。（3）通过流式细胞术检测细胞周期实验,考察益气除痰方、miR-182 mimics、miR-182 inhibitor在非小细胞肺癌细胞系上,对细胞周期的影响。（4）通过细胞免疫荧光实验、细胞免疫组化、Western-blot实验,评估益气除痰方干预48h后,对A549细胞miR-182-5p/ATG7自噬通路、Bcl-2家族与内在凋亡诱导通路的影响。（5）分别从加药前、加药12h、加药24h、加药48h,分别用细胞免疫荧光、Western-blot、细胞免疫组化实验,观察自噬相关指标如Atg7、Beclin-1、LC-3 A/B、P62等的变化。（6）细胞免疫荧光实验,观察加药0min、20min、40min、60min、90min、2hour、8hour、10hour、12hour、24hour、48hour,LC3 A/B、Beclin-1的变化。结果:第一部分:miR-182调控自噬和凋亡（1）转染miR-182-5p mimic 48h可使A549细胞系中miR-182-5p的表达上升。（2）miR-182-5p表达上升,自噬相关基因蛋白ATG7表达随着下降。（3）miR-182-5p mimic抑制A549、95D细胞增殖,促进凋亡。（4）miR-182-5p mimic干预48h,可抑制A549、95D细胞中自噬相关蛋白如LC3等的表达,下调抑癌Bcl-2的表达。第二部分:基于miR-182探讨益气除痰方干预NSCLC自噬和凋亡机制研究（1）益气除痰方对非小细胞肺癌细胞有效浓度为2mg/ml;（2）益气除痰方可抑制非小细胞肺癌细胞增殖,从而促进肺癌细胞的凋亡;（3）加入2mg/ml的益气除痰方后,A549细胞自噬膜（LC3 A/B）的形成分为两个高峰,一个是加药后20min-40min;第二个高峰是加药后2小时到10小时。（4）加入2mg/ml的益气除痰方后,自噬膜第一个高峰,A549细胞在加药20min、40min时,自噬膜（LC3 A/B）的形成增加,但Beclin-1表达未增加,可能与抗凋亡蛋白bcl-2释放结合Beclin-1有关。（5）加入2mg/ml的益气除痰方后,自噬膜第二个高峰,加药后2小时,Beclin-1表达增加,自噬膜（LC3 A/B）表达再度增加,且持续到加药后10小时,直至加药后12小时。（6）益气除痰方干预48h,可抑制A549、95D、95C细胞中自噬相关蛋白如LC3等的表达,下调Bcl-2的表达,促进凋亡。结论:1、miR-182调控晚期非小细胞肺癌自噬相关基因Atg7、LC3 A/B等的表达,抑制细胞自噬;2、miR-182抑制NSCLC增殖,调控抑凋亡Bcl-2蛋白亚家族,诱导晚期非小细胞发生凋亡;3、益气除痰方上调miR-182表达,调控晚期非小细胞肺癌自噬相关基因Atg7、LC3 A/B等的表达,抑制细胞自噬;4、益气除痰方上调miR-182表达,调控抑凋亡Bcl-2蛋白亚家族,诱导晚期非小细胞发生凋亡。5、miR-182-5p mimic可能对于晚期远处转移（恶性程度较高）的非小细胞肺癌效果更佳,miR-182-5p mimic抑制其自噬水平,促进其凋亡。