褐飞虱是重要的农业害虫,在世界各地造成了巨大的粮食生产损失,作为新烟碱类杀虫剂的代表,吡虫啉曾一度是主要的防治药剂和当家品种,但从2005年以来褐飞虱对吡虫啉的抗性持续上升,限制了该药剂的继续使用。烟碱型乙酰胆碱受体是新烟碱类杀虫剂的作用靶标。为了进一步了解褐飞虱对吡虫啉的抗药性机制,建立有效的抗药性治理策略,提高药剂的药效和合理使用方法,本文通过田间褐飞虱的抗性生物测定、室内敏感品系的诱变、吡虫啉高剂量筛选,分析筛选试虫靶标基因序列的多态性变化,鉴定关键多态性位点,并通过外源表达分析了多态性位点对应的氨基酸变化对吡虫啉敏感性的影响发现了烟碱型乙酰胆碱受体(nicotinic acetylcholine receptors, nAChRs) β1亚基的抗性相关的功能突变位点。具体结果如下。一、褐飞虱对吡虫啉的抗性调查对2010年采自我国南宁等12个地区的褐飞虱田间种群进行了抗药性监测,并以室内连续饲养多年的敏感品系作为敏感基线,以改进的稻茎浸渍法作为生物测定方法。结果发现,12个田间褐飞虱种群均已对吡虫啉产生了明显的抗性,以南京等10个地区的抗性更为显著,其中南京地区的褐飞虱种群对吡虫啉的抗性已达到了155.9倍。可见,不同地区褐飞虱种群均已经对吡虫啉产生了高水平抗性,大部分地区抗性水平超过110倍,而且地区之间存在较大差异,这说明了田间褐飞虱种群对吡虫啉抗性发展迅速。2010年褐飞虱对吡虫啉抗性的快速上升,原因可能有两点：一是尽管政府部门建议暂停吡虫啉单剂用于褐飞虱的防治,但部分地区仍在大量使用；二是在越南、泰国等国家使用吡虫啉之后,抗性褐飞虱迁飞进入我国。二、田间褐飞虱nAChR β1亚基胞外区氨基酸多态性分析根据已有的褐飞虱nAChR β1亚基核苷酸序列设计特异性引物,并采用RT-PCR技术扩增了褐飞虱室内敏感品系与28个不同地区的田间种群nAChR β1亚基功能区的cDNA片段,测序分析并进行序列对比。结果发现,在检测的28个地理种群中,有16个地区的种群发生了不同数量的氨基酸突变,并且有部分氨基酸多态性在不同地区的褐飞虱种群中都有发生。其中K75Q和R81Q位于loop D,K188E和N189D位于loop F。这些发生在nAChR (31亚基特异性大环上的突变可能与褐飞虱对吡虫啉抗性变化有关。三、室内褐飞虱诱变品系nAChR (31亚基胞外区氨基酸多态性分析采取人工诱变的方法研究褐飞虱烟碱型乙酰胆碱受体β1亚基胞外区基因突变。其中化学诱变采用秋水仙素浸泡,物理诱变采用紫外线辐射。经人工诱变的卵块孵化后,在三龄时进行LC95高浓度筛选,克隆存活试虫的烟碱型乙酰胆碱受体β1亚基胞外区,其中经秋水仙素诱变的褐飞虱β1亚基胞外区第21位丙氨酸发生缺失,而经紫外诱变的褐飞虱β1亚基胞外区第81位精氨酸突变为谷氨酰胺,该突变位于β1亚基特异性环loop D上,推测该突变可能与吡虫啉抗性有关。四、氨基酸多态性在褐飞虱对吡虫啉选择性中的影响针对田间种群和诱变种群中发现的关键位点突变,对一些地区的褐飞虱种群进行超高剂量筛选(利用3龄若虫测定LC99,再用2×LC99浓度筛选同一种群同一世代的4龄若虫)后,发现了一些多态性位点出现的频率上升。经筛选后,重庆种群R81Q,南京种群K75Q,惠州种群K188E出现频率上升。利用褐飞虱β1亚基的loopD和loopF分别替换小鼠β2亚基的对应序列,构建嵌合体亚基,并在嵌合体亚基上引入多态性位点对应的突变,构建突变亚基。将构建的突变β2亚基与褐飞虱α1亚基在非洲爪蟾卵母细胞中共表达,分析氨基酸替换对吡虫啉敏感性的影响,发现loopD上的K75Q、R81Q和loop F上的K188E、N189D氨基酸替换均显著影响吡虫啉的激动剂效应。同时,loop F上的K188E和N189D两个氨基酸替换对吡虫啉激动剂效应的影响更为显著,这表明了在田间种群中多个氨基酸替换同时存在时,可能对吡虫啉敏感性影响更大。综上所述,本文通过不同国家褐飞虱田间种群和室内诱变种群nAChRs β1亚基胞外区多态性的研究,发现了多个重要的氨基酸突变,并证实这些突变对吡虫啉的敏感性存在显著的影响。由于这些氨基酸突变在田间确实存在,因此可能代表了田间褐飞虱种群靶标不敏感性机制,进一步筛选明确田间种群主要靶标突变后,可以应用于褐飞虱对以吡虫啉为代表的新烟碱类杀虫剂抗性的治理和褐飞虱的综合防治。