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背景子宫内膜异位症（endometriosis,EMS）是指具有生长功能的子宫内膜样组织附着并生长在宫腔以外的良性妇科疾病,在育龄期妇女中的发病率约为6-10%。虽然EMS的发病机制仍未阐明,但最广为接受的理论是由Sampson在1920年提出的经血逆流学说,该学说认为子宫内膜组织通过输卵管逆行输送到子宫腔以外部位（如盆腔、卵巢、腹膜等）,黏附并建立血液供应,内膜细胞增殖,进而形成子宫内膜异位病灶。这一学说表明EMS的发生、发展离不开异位内膜细胞的增殖。研究发现,Notch通路在EMS中起关键作用,并参与细胞的增殖,激活Notch通路可以促进增殖的发生,失活时抑制其发生,进一步提示了Notch通路可能是通过调节子宫内膜细胞的增殖来参与EMS的发生和发展。内异消是本课题组创制的治疗EMS的新中药单体复方,来源于妇科名方“佛手散”中当归、川芎的主要成分川芎嗪、阿魏酸,加上延胡索乙素组成。前期研究发现其可有效抑制EMS的发生,但是,内异消是否对异位内膜的增殖有抑制作用,此作用是否与Notch通路相关,不得而知。本研究旨在探究Notch通路介导的内异消抑制异位内膜增殖的作用机制,为内异消治疗EMS提供依据。目的进一步验证内异消对EMS增殖的作用,研究其作用机制是否与下调Notch通路,进而抑制Ki67、PCNA有关,探究Notch通路能否通过作用于Ki67、PCNA去影响EMS增殖,这将为内异消治疗EMS提供理论依据。方法1.大鼠自体移植EMS模型的复制及分组选取动情期SD大鼠,采取自体移植法建立EMS模型。造模28天后,观察异位内膜生长情况和体积,移植物体积增大,内有高度不小于2 mm的积液,体积不小于8 mm~3。将造模成功的SD大鼠随机分为模型组、45、90、180 mg·Kg-1内异消组,另设6只正常雌性SD大鼠为空白对照组,连续给药28天后,观察异位内膜体积变化。2.裸鼠异体移植EMS模型的复制及分组选取动情期C3H小鼠,摘取双侧子宫并剪成4 mm~2的组织块,将子宫段移植到裸鼠腹部皮下,建立EMS模型。造模28天后,观察异位组织生长情况。裸鼠腹部出现结节状凸起,内有高度不小于1 mm的积液,体积不小于4 mm~3。选取造模成功的裸鼠,随机分为模型组、90、180、360 mg·Kg-1内异消组,另设6只正常雌性C3H小鼠为空白对照组。连续给药28天后,观察异位组织体积变化。3.内异消体内对异位内膜增殖的影响在自体和异体移植模型中,分别取空白对照组的正常子宫内膜组织、模型组和内异消组的异位组织,提取总RNA和总蛋白,用RT-qPCR、Western blot法,分别检测增殖基因蛋白Ki67、PCNA的变化。4.内异消体外对子宫内膜细胞增殖的影响选取人永生化EMS患者在位内膜间质细胞hEM15A和子宫内膜腺癌细胞HEC1-B,首先用平板克隆和MTT法,检测内异消对hEM15A、HEC1-B细胞增殖能力的影响。然后用RT-qPCR和Western blot法,分别检测内异消对增殖基因蛋白Ki67、PCNA的影响。5.Notch通路在内异消抑制增殖中的作用在自体、异体移植模型和hEM15A、HEC1-B细胞中,用RT-qPCR、Western blot法,检测内异消对Notch通路中Notch1、NICD1、Notch2、NICD2、Hes1和Hey1的影响。运用Notch通路激动剂Jagged1或抑制剂DAPT,分别联合内异消后,用RT-qPCR和Western blot法,检测hEM15A、HEC1-B细胞中Notch通路以及增殖相关基因蛋白的变化,运用平板克隆和MTT法,检测对hEM15A、HEC1-B细胞增殖能力的影响。结果1.内异消体内能显著抑制异位内膜的体积（1）大鼠自体移植EMS模型中,给药前各组异位内膜体积无显著差异（P>0.05）。连续给药28天后,开腹发现内异消组的异位内膜体积明显减小,血管减少,粘连减少。与给药前相比,45 mg·Kg-1内异消组异位内膜体积显著减小为83.40±6.99 mm~3（P<0.05）。与给药前相比,90和180 mg·Kg-1内异消组异位内膜体积分别显著减小为41.10±20.99、16.33±10.40 mm~3（P<0.01）。（2）在裸鼠异体移植模型中,给药前各组异位内膜体积无显著差异（P>0.05）。给药28天后,肉眼发现内异消组腹部凸起明显缩小,粘连减少,表面血管数量减少。与给药前相比,90和360 mg·Kg-1内异消组异位内膜体积分别显著减小为10.01±5.97、12.56±7.65 mm~3（P<0.05）。与给药前相比,180 mg·Kg-1内异消组异位内膜体积显著减小为12.56±7.65 mm~3（P<0.01）。2.内异消体内抑制异位内膜增殖的作用RT-qPCR结果表明,在大鼠自体移植和裸鼠异体移植模型中,与空白对照组相比,模型组Ki67、PCNA mRNA水平显著上调（P<0.01）。与模型组相比,内异消各组Ki67和PCNA mRNA水平均显著下降（P<0.01）。Western blot结果表明,在自体移植模型中,与空白对照组相比,模型组Ki67、PCNA蛋白表达水平显著增加（P<0.05）。与模型组比,45、90 mg·Kg-1内异消组Ki67和PCNA蛋白表达水平均显著降低（P<0.05）。在异体移植模型中,与空白组相比,模型组Ki67、PCNA蛋白的表达显著增加（P<0.01）。与模型组比,内异消各组Ki67、PCNA蛋白表达水平均显著降低（P<0.05）。3.内异消体外抑制子宫内膜细胞的增殖作用平板克隆结果表明,在hEM15A和HEC1-B细胞中,与空白对照组相比,内异消各组所形成的克隆体积更小,数量更少（P<0.05）。MTT结果表明,第6天时,960μg·m L-1内异消组能明显抑制hEM15A细胞数（P<0.05）,而625、1250μg·m L-1内异消对HEC1-B细胞的抑制作用较显著（P<0.05）。RT-qPCR结果表明,内异消作用于hEM15A、HEC1-B细胞后,与空白对照组相比,内异消能显著下调子宫内膜细胞中Ki67和PCNA基因表达水平（P<0.05）。Western blot结果表明,与空白对照组比,内异消显著下调Ki67、PCNA蛋白表达水平（P<0.05）。4.内异消下调Notch通路（1）内异消体内抑制Notch通路的活性RT-qPCR结果表明,在自体和异体移植模型中,模型组Notch1、Notch2、Hes1和Hey1 mRNA水平显著增加（P<0.05）。相较于模型组,内异消显著降低Notch1、Notch2、Hes1和Hey1 mRNA水平（P<0.05）。Western blot结果表明,在自体和异体移植模型中,模型组Notch1、NICD1、Notch2、NICD2、Hes1和Hey1蛋白表达水平显著上调（P<0.05）,而内异消显著下调Notch1、NICD1、Notch2、NICD2、Hes1和Hey1蛋白表达水平（P<0.05）。（2）内异消体外抑制Notch通路的活性RT-qPCR结果表明,在hEM15A和HEC1-B细胞中,内异消显著下调Notch1、Notch2、Hes1和Hey1 mRNA水平（P<0.05）。但是,低浓度内异消能够在hEM15A细胞中上调Notch2和Hey1 mRNA水平（P<0.05）,在HEC1-B细胞中上调Notch1mRNA水平（P<0.05）。Western blot结果表明,内异消作用于hEM15A、HEC1-B细胞后,与空白对照组比,内异消显著下调Notch1、NICD1、Notch2、NICD2、Hes1和Hey1蛋白表达水平（P<0.05）。（3）Notch通路介导的内异消抑制增殖运用Notch通路激动剂Jagged1,通过上调Notch1、NICD1、Notch2、NICD2、Hes1和Hey1的表达,激活Notch通路,增加Ki67和PCNA,促进细胞增殖。内异消联用Jagged1,与Jagged1组比,Notch通路Notch1、NICD1、Notch2、NICD2、Hes1和Hey1蛋白表达减少,增殖Ki67和PCNA蛋白随之下降,表明内异消拮抗Jagged1对Notch通路的激活作用,削弱Jagged1促进增殖的作用。运用Notch通路抑制剂DAPT,通过下调Notch1、NICD1、Notch2、NICD2、Hes1和Hey1的表达,使Notch通路失活,降低Ki67和PCNA,抑制细胞增殖。内异消联用DAPT,与DAPT组比,Notch通路Notch1、NICD1、Notch2、NICD2、Hes1和Hey1的蛋白表达下调,增殖Ki67和PCNA蛋白随之下调,表明内异消协同DAPT对Notch通路的抑制作用,增强DAPT抑制增殖的作用。结论综上所述,内异消能从体内和体外抑制异位内膜的增殖能力,其作用机制可能是通过下调Notch通路实现的。