骨髓增生异常综合征(Myelodys0plastic Syndromes,MDS)是一组具有高度危险性向急性髓系白血病(Acute Myelocytic Leukemia,AML)转化的髓系克隆性疾病。目前,MDS的发病机制复杂且尚未清楚,有研究表明骨髓的血管新生参与MDS的发病机制,骨髓血管新生成为MDS发病机制研究的一个新热点。缺氧诱导因子-1α(Hypoxia inducible factor 1 alpha,HIF-1α)是缺氧条件下参与血管生成的重要调控因子,与VEGF共同参与血管生成。而血小板衍生生长因子-B(Platelet derived growth factor subunit B,PDGF-B)是PDGF家族中一员,也是血管新生的调控因子。有研究表明HIF-1α与PDGF-B的表达具有相关性,并且共同参与侵袭性乳腺癌的血管生成通路。目前,仅有一篇英文文献报道HIF-1α与MDS的发生和预后有一定的相关性,然而PDGF-B在MDS中尚未有研究。微小RNA(MicroRNA,miRNA)是一类长度短小的非编码单链RNA,它能与其靶向的基因相结合,抑制靶基因的蛋白翻译或降解靶基因的mRNA,从而调控下游靶基因的表达和其生物学功能。本课题组结合前期工作,进一步研究HIF-1α和PDGF-B在MDS中的表达意义和相关性;并发现miR-93-5p与HIF-1α和PDGF-B有结合位点,进而研究miR-93-5能否靶向结合HIF-1α和PDGF-B在MDS中发挥生物学功能。材料和方法1.收集82例MDS患者、12例MDS转AML患者以及33例(未累及骨髓的淋巴瘤患者)对照患者共127例骨髓组织蜡块,采用免疫组织化学法检测所有骨髓组织蜡块中HIF-1α和PDGF-B的蛋白表达水平,并结合临床参数分析HIF-1α和PDGF-B在MDS以及AML中的表达意义。2.在GEO、ArrayExpress、Pubmed数据库中,通过检索并筛选含有MDS和对照组或含有AML和MDS的基因芯片或文献;接着,对MDS相关基因芯片进行差异基因的分析,并对筛选出来的差异基因并进行通路富集等生物学功能分析。3.提取MDS相关基因芯片中HIF-1α和PDGF-B的表达数据,分析芯片数据中HIF-1α和PDGF-B的表达水平与MDS、AML的关系,并进行连续型变量合并SMD的meta分析和联合诊断SROC的meta分析,进一步分析基因芯片中HIF-1α和PDGF-B在MDS中的表达意义。4.通过对CCLE、GEPIA和THE HUMAN PROTEIN ATLAS数据库的数据提取,获取HIF-1α和PDGF-B在Pan cancer中的表达情况,分析HIF-1α和PDGF-B的表达水平与肿瘤的关系。5.通过MEM数据库分别获取HIF-1α和PDGF-B的相关基因,对两个基因集取交集得到的基因进行通路富集等生物功能分析,进而对HIF-1α和PDGF-B的表达意义进行进一步的探索与验证。6.通过miRWalk数据库分别预测HIF-1α和PDGF-B的靶向miRNA,通过筛选与HIF-1α和PDGF-B均靶向结合并且有结合位点的miRNA,并与GSE76775芯片中的MDS与对照组的差异miRNA取交集,找出能靶向结合HIF-1α和PDGF-B的miRNA。7.通过starBase V2.0数据库发掘HIF-1α和PDGF-B与miR-93-5p在其他肿瘤中的相关性;并通过OncomiR、YM500数据库获取miR-93-5p在Pan cancer中的表达情况,进一步探究肿瘤中miR-93-5p与HIF-1α和PDGF-B的关系。8.通过双荧光素酶试验验证miR-93-5p是否在MDS中能靶向结合HIF-1α,验证HIF-1α和PDGF-B能否作为miR-93-5p的靶基因在MDS中发挥生物学功能。结果(一)使用免疫组织化学技术研究HIF-1α和PDGF-B在MDS组织中的表达及其意义1.通过免疫组化检测发现,HIF-1α在MDS组骨髓组织中的阳性率(90.24%)高于对照组骨髓组织中的阳性率(72.73%),并具有统计学意义(P<0.05),这提示HIF-1α在MDS骨髓组织中表达上调。2.在MDS患者中,HIF-1α(+)患者的白细胞数(均值=3.65×10~9/L)显著多于HIF-1α(-)患者的白细胞数(均值=2.51×10~9/L)(P<<0.001);而且HIF-1α(+)患者的中性粒细胞(均值=1.92×10~9/L)显著多于HIF-1α(-)患者的中性粒细胞(均值=1.31×10~9/L)(P<0.05)。通过对HIF-1α(+)的患者进行生存分析,发现在性别、WHO分型、染色体核型预后、IPSS分级和原始细胞百分比的分组组别中,生存时间有显著差异(P<0.05);而且在与MDS不良预后相关的组别(男性组、RAEB1/RAEB2组、染色体预后不良组、IPSS高危组和原始细胞≥5%组)中,其平均生存期较短。3.通过免疫组化检测发现,PDGF-B在MDS组骨髓组织中的阳性率(98.78%)高于对照组骨髓组织中的阳性率(78.79%),并具有统计学意义(P<0.001),这表明PDGF-B在MDS骨髓组织中的表达上调。4.通过对PDGF-B(+)的患者进行生存分析,发现在性别、WHO分型、染色体核型预后、IPSS分级和原始细胞百分比的组别中生存时间有显著差异(P<0.05),而且在男性组、RAEB1/RAEB2组、染色体预后不良组、IPSS高危组和原始细胞≥5%组中,这些与MDS不良预后相关的组别的平均生存期较短。5.对HIF-1α和PDGF-B的免疫组织化学数据进行相关性分析,发现在MDS骨髓组织中HIF-1α和PDGF-B的表达水平呈正相关(r=0.19,P<0.05)。(二)使用计算生物学研究HIF-1α和PDGF-B在MDS中的表达和意义1.从14个与MDS相关的基因芯片中获得310个差异基因,这些差异基因主要参与B细胞活化、B细胞受体信号通路、造血细胞谱系、TGF-β信号通路和EGF受体信号传导途径等,通过PPI(Protein-protein interaction)分析发现CD19、TLR4、IRF4、CXCR4、APAF1等是整个PPI的核心节点。2.HIF-1α在GSE2779、GSE18366、GSE41130和GSE61853芯片中,MDS组的平均表达水平高于对照组;尤其是在GSE18366芯片中,MDS组的HIF-1α的水平显著高于对照组的水平(P<0.05),且在ROC诊断试验中有显著统计学意义(AUC=0.77,P<0.05)。PDGF-B在GSE4619、GSE18366、GSE30195、GSE30201、GSE41130、GSE43399、GSE51757、GSE58831、GSE81173和GSE15061芯片中,MDS组的平均表达水平高于对照组;在GSE30201和GSE81173芯片中,MDS组的PDGF-B的水平显著高于对照组的水平(P<0.01),且在ROC诊断试验中有显著统计学意义(AUC=0.80,P<0.05和AUC=0.83,P<0.05);表明PDGF-B不仅在MDS基因芯片中表达上调,且对MDS具有一定的诊断意义。3.PDGF-B在MDS组和对照组的14个芯片数据中,用固定效应模型进行meta分析,SMD=0.27(0.09,0.44),z值为2.60,P值为0.009,表达差异有统计学意义,PDGF-B在MDS基因芯片中表达上调;PDGF-B的合并敏感度为0.63(0.48-0.76),合并特异度为0.74(0.57-0.86),SROC曲线下面积为0.74(0.70-0.78)。PDGF-B对MDS有中等诊断价值。4.HIF-1α在GSE15061(p<0.05)中,AML组表达水平高于MDS组;而在GSE25300(p<0.05)、GSE51082和GSE61804(p<0.05)中,AML组表达水平低于MDS组。PDGF-B在GSE51082(p<0.001)和GSE15061中,AML组表达水平高于MDS组;而在GSE25300和GSE61804(p<0.01)中,AML组表达水平低于MDS组。5.HIF-1α在AML组和MDS组的4个芯片数据中,用随机效应模型进行meta分析,SMD检测的z值为1.11,P值为0.266,异质性检验I~2=83.7%,P<0.001,菱形与无效线相交,表达差异无统计学意义;HIF-1α的合并敏感度为0.59(0.49-0.69),合并特异度为0.90(0.77-0.96),SROC曲线下面积为0.78(0.74-0.82)。PDGF-B在AML组和MDS组的4个芯片数据中,用固定效应模型进行meta分析,SMD检测的z值为0.10,P值为0.922,异质性检验I~2=85.9%,P<0.001,菱形与无效线相交,表达差异无统计学意义;PDGF-B的合并敏感度为0.63(0.48-0.76),合并特异度为0.74(0.57-0.86),SROC曲线下面积为0.74(0.70-0.78)。6.在GEPIA数据库30种肿瘤数据中,HIF-1α在24种肿瘤中的表达上调,尤其是在食管癌、颈部鳞状细胞癌、多形性成胶质细胞瘤、肺鳞状细胞癌、低级别脑胶质瘤、急性骨髓性白血病和胃腺癌中显著上调。而PDGF-B在肿瘤中表达有差异,在15种肿瘤组织的表达上调,特别是淋巴样肿瘤弥漫性大B细胞淋巴瘤、食管癌、头颈部鳞状细胞癌、肝细胞癌、卵巢浆液性囊腺癌、胰腺癌、胸腺瘤中中显著上调。7.在MEM数据库中获取到HIF-1α和PDGF-B均有相关的605个基因,进行通路分析发现它们主要参与癌症途径、TNF信号通路、B细胞受体信号通路、调节干细胞多能性的信号通路、病毒癌变、MAPK信号传导途径、胰腺癌等。通过PPI分析发现JUN、UBC、VEGFA、RELA、CALM1等蛋白是整个PPI的核心节点。(三)HIF-1α和PDGF-B在MDS中作为MiR-93-5p靶基因发挥生物学功能1.通过选择miRWalk数据库中的四个预测靶基因的平台分别预测HIF-1α和PDGF-B的靶向miRNA,取两个基因均大于或等于4个平台都共有的miRNA与GSE76775芯片中的MDS与对照组的差异miRNA交集,发现有且仅有mir-93-5p能同时靶向结合HIF-1α和PDGF-B基因。2.利用starBase V2.0数据库,在Pan-cancer project中发现,HIF-1α和PDGF-B与miR-93-5p在多种肿瘤中呈负相关性。MiR-93-5p与HIF-1α在尿路上皮膀胱癌、结直肠腺癌、透明细胞肾癌、急性粒细胞白血病和乳头状甲状腺癌呈负相关。PDGF-B与miR-93-5p在乳腺癌、结直肠腺癌、肺腺癌、肺鳞癌、在子宫体子宫内膜癌、皮肤黑素瘤和卵巢浆液性囊腺癌呈负相关。MiR-93-5p与HIF-1α、PDGF-B在肿瘤中呈负相关性,进一步的提示HIF-1α和PDGF-B可能作为miR-93-5p的靶基因在MDS中发挥作用。3.双荧光素酶实验证实miR-93-5p能靶向结合HIF-1α,验证HIF-1α和PDGF-B可能作为miR-93-5p的靶基因在MDS中发挥生物学功能。结论1.HIF-1α在MDS骨髓组织中表达上调;且在HIF-1α(+)的患者中,MDS患者的生存时间与不良预后因素相关;再者,HIF-1α(+)有助于MDS的诊断。2.PDGF-B在MDS骨髓组织中表达上调;且在PDGF-B(+)的患者中,MDS患者的生存时间与不良预后因素相关;再者,PDGF-B(+)有助于MDS的诊断。3.在MDS中,HIF-1α和PDGF-B均表达上调,而且两者呈正相关。4.MiR-93-5p靶向结合HIF-1α;在MDS中miR-93-5p可能通过靶向结合HIF-1α和PDGF-B发挥生物学功能,但仍需后续实验加以进一步验证。