增生性瘢痕(hypertrophic scar,HS)是人类皮肤受损、创面愈合后局部组织过度纤维化的结果,其组织学研究证实,创面修复后期,成纤维细胞(fibroblast,Fb)的过度增殖及合成、分泌旺盛引起细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的过度沉积,是HS的主要生物学基础。由于目前HS的发病机制还不十分清楚,临床上缺乏行之有效的治疗手段,因此HS一直是整形外科领域研究的焦点。研究表明,HS的发生、发展主要是由Fb、ECM和生长因子三者的协同的作用所致,如何在生长因子调控作用下,合理地抑制Fb的过度增殖与诱导其凋亡是HS防治研究的中心策略。结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)是一种在纤维化病程中发挥重要作用的细胞因子。在病理情况下,CTGF的过度表达与某些增生性和纤维化性疾病的发生、发展密切相关,如硬皮病、肾纤维化、肝硬化、肺纤维化、动脉粥样硬化等。我们前期研究表明CTGF蛋白质和mRNA在HS中的表达高于正常皮肤(normal skin, NS);CTGF能够促进HS Fb的增殖、分化及免于凋亡;CTGF能够促进以胶原为主的细胞外基质的沉积。但是其发挥促纤维化作用的具体细胞内信号转导通路尚不清楚。PI3K/Akt是体内重要的信号转导通路之一,在维持细胞的正常生理功能如生长、分化、代谢及细胞骨架重排中起着关键的作用。磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide3-kinase, PI3K)是一种与细胞内信号传导有关的第二信使。它能磷酸化磷脂酰肌醇(phosphatidylinosistol, PI)的第三位羟基生成磷酸化磷脂酰肌醇三磷酸(phosphatidylinositoltri-phosphate, PIP3)。Akt又称蛋白激酶B(protein kinase B, PKB),是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,在细胞内信号转导系统中位于PI3K的下游,是癌基因v-Akt编码产物的同系物。Akt主要通过对含有丝氨酸/苏氨酸残基的底物磷酸化而发挥广泛的生物学效应,包括抗凋亡、促进细胞增殖、转分化等作用。迄今为止,关于PI3K/Akt信号转导通路与CTGF促HS纤维化作用之间的关系研究甚少,仅有刘玉丽等通过免疫组化染色对40例病理性瘢痕组织中p-Akt的表达进行检测,发现其表达高于非病理性瘢痕和正常皮肤的报道。为此,本研究拟以人HS Fb为研究对象,运用免疫细胞化学染色、RT-PCR、Western-Blot、流式细胞仪、MTT等多种技术,在观察HS Fb PI3K蛋白质和mRNA的表达特征的基础上,探讨CTGF对PI3K/Akt信号通路是否具有激活作用及其量效关系,以及阻断该通路对HS Fb增殖、凋亡与转分化的作用。实验结果将为深入研究CTGF在HS发病机制中的作用和治疗学意义提供理论依据,也将为进一步完善CTGF调控组织纤维化的信号转导分子机制提供帮助。实验设计:1、体外培养HS Fb和NS Fb,应用免疫细胞化学染色和反转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)技术检测PI3K蛋白质和mRNA的表达,以明确体外培养HS Fb中PI3K的表达特征。2、体外培养HS Fb,以10ng/ml浓度外源性重组人CTGF刺激体外培养HS Fb,应用Western-Blot技术检测不同时相点(0min、5min、15min、30min、60min、120min)p-Akt信号分子的表达,以观察CTGF对PI3K/Akt信号通路是否具有激活作用。在此基础上,以不同浓度(2.5ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml)外源性重组人CTGF刺激体外培养HS Fb,应用Western-Blot技术检测刺激作用30 min后p-Akt信号分子的表达,以观察不同浓度CTGF与PI3K/Akt信号通路激活的量效关系。应用Western-blot技术检测不同浓度(1μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、50μmol/L)PI3K特异性抑制剂LY294002预阻断后再以外源性重组人CTGF刺激细胞p-Akt信号分子的表达,以观察上游信号分子PI3K抑制剂对PI3K/Akt信号通路的阻断作用及其量效关系;3、体外培养HS Fb,预先应用PI3K信号分子抑制剂LY294002处理HS Fb,再应用外源性重组人CTGF进行刺激,实验分四组:①空白对照组;②单纯刺激组;③单纯阻断组;④预阻断后刺激组。通过MTT比色实验检测HS Fb的增殖活力,通过Western-Blot技术检测Fb向肌Fb转分化的标志物a-平滑肌肌动蛋白的表达,通过PI和Annexin v染色流式细胞术检测HS Fb凋亡。同时应用免疫细胞化学染色及Western-Blot技术检测PI3K/Akt信号通路的核内靶蛋白PCNA和NF-κB的表达,以明确PI3K/Akt信号通路对人增生性瘢痕成纤维细胞生物学行为的影响及分子机制。结果:1、人增生性瘢痕成纤维细胞PI3K表达特征的实验观察免疫细胞化学染色结果表明,PI3K蛋白质定位于细胞浆内,经图像半定量分析,体外培养HS Fb中存在PI3K蛋白质(0.614±0.150)和mRNA(0.50±0.16)的高表达,NS Fb中PI3K蛋白质(0.248±0.046)和mRNA(0.18±0.07)的表达较弱,统计学处理,差别具有非常显著性意义(P<0.01)。2、人增生性瘢痕成纤维细胞PI3K/Akt信号通路与结缔组织生长因子的关联性2.1、10 ng/ml外源重组人CTGF作用于体外培养的HS Fb 15 min时,Akt的磷酸化水平(以p-Akt/ Akt表示,0.509±0.024)已明显高于空白对照组(0.383±0.018,P<0.05),30 min时Akt的磷酸化水平最明显(0.644±0.040,P<0. 01),而且持续至少达120 min以上。2.2、随着外源重组人CTGF浓度(分别为2.5ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml)的增加,Akt的活化水平逐渐增高,呈正相关的剂量依赖效应。与空白对照组比较,除2.5ng/ml浓度无统计学意义外(P >0.05),其余均具有统计学差异,分别为P <0.05(5 ng/ml)、P< 0.05(10 ng/ml)、P< 0.01(20ng/ml)、P< 0.05(50ng/ml)。2.3、随着PI3K特异性抑制剂LY294002浓度的增加(分别为1μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、50μmol/L),Akt的磷酸化水平逐渐下降,分别为0.346±0.020、0.110±0.042、0.056±0.013、0,LY294002浓度为50μmol/ L时基本完全阻断了外源重组人CTGF对PI3K /Akt信号通路的激活作用。3、PI3K/Akt信号通路对人增生性瘢痕成纤维细胞生物学行为的影响及分子机制3.1、增殖活力:单纯刺激组HS Fb OD值增加十分明显(24h为0.758±0.026,48h为0.814±0.038,72h为0.796±0.045),和空白对照组及单纯阻断组相比,具有非常显著性差异(P<0.01),和预阻断后刺激组(24h为0.524±0.025,48h为0.570±0.018,72h为0.556±0.040)相比,具有显著性差异(P<0.05)。预阻断后刺激组HS Fb OD值,和空白对照组及单纯阻断组相比,具有显著性差异(P<0.05)。空白对照组和单纯阻断组之间相比,无显著性差异(P>0.05)。3.2、转分化:单纯刺激组HS Fb a-平滑肌肌动蛋白增加十分明显(0.75±0.21),和空白对照组(0.38±0.14)及单纯阻断组(0.34±0.16)相比,具有非常显著性差异(P<0.01),和预阻断后刺激组(0.50±0.12)相比,具有显著性差异(P<0.05)。预阻断后刺激组,和空白对照组及单纯阻断组相比,具有显著性差异(P<0.05)。空白对照组和单纯阻断组之间相比,无显著性差异(P>0.05)。3.3、凋亡:和空白对照组(8.63±1.92%)相比,单纯刺激组细胞凋亡指数下降(1.78±0.27%),统计学分析,差别具有显著性(P<0.05);预阻断后刺激组细胞凋亡指数(8.22±2.04%)上升,和单纯刺激组相比,统计学分析,差别具有显著性(P<0.05)。空白对照组、单纯阻断组和预阻断后刺激组相比较,无统计学差异(P>0.05)3.4、PCNA的表达: PCNA染色阳性信号为棕黄色颗粒,定位于细胞核内。图象半定量分析结果表明,单纯刺激组HS Fb中PCNA阳性颗粒分布面密度最高,预阻断后刺激组HS Fb PCNA阳性颗粒分布面密度次之,空白对照组及单纯阻断组HS Fb PCNA阳性颗粒分布面密度最低。统计学分析,单纯刺激组与预阻断后刺激组相比,具有显著性差异(P<0.05);单纯刺激组与空白对照组和单纯阻断组,具有非常显著性差异(P<0.01);空白对照组和单纯阻断组之间相比,无显著性差异(P>0.05)。3.5、NF-κB的表达:单纯刺激组HS Fb NF-κB增加十分明显,和空白对照组、单纯阻断组及预阻断后刺激组相比,具有非常显著性差异(P<0.01)。空白对照组、单纯阻断组和预阻断后刺激组三者之间相比较,无统计学差异(P>0.05)。结论:1、体外培养人增生性瘢痕成纤维细胞中PI3K在蛋白质和mRNA水平的表达高于其在正常皮肤成纤维细胞中的表达。2、结缔组织生长因子对人增生性瘢痕成纤维细胞中PI3K/Akt信号通路具有特异性激活作用,30 min时Akt磷酸化水平最明显,然后逐渐下降,持续至少达120 min以上;结缔组织生长因子激活PI3K/Akt信号通路具有剂量依赖效应,在20ng/ml达到最大刺激效应。PI3K抑制剂LY294002可以抑制此信号通路的激活,并具有剂量依赖效应,在50μmol/L浓度时可以完全抑制结缔组织生长因子对PI3K/Akt信号通路的激活。3、PI3K/Akt信号通路介导了结缔组织生长因子促人增生性瘢痕成纤维细胞增殖及向肌成纤维细胞的转分化,并介导人增生性瘢痕成纤维细胞免于凋亡,其可能机制为上调增殖细胞核抗原和核转录因子-κB的表达。