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研究背景与目的支气管哮喘(简称哮喘)本质上属于气道慢性炎症疾病,遗传因素和外界环境因素均可影响其发病。全球约有三亿哮喘患者,中国就占十分之一,而且中国是哮喘致死率最高的国家之一。支气管哮喘还具有明显异质性,不同病人之间及同一病人不同时期其哮喘临床表现、病情严重程度、治疗反应等可能不同。这种“不同”其实是个体内因(遗传因素)和外因(环境因素)共同作用的结局。以往认为嗜酸性粒细胞(Eos)在气道内聚集和浸润是哮喘的主要炎症特征或表型,但近期研究发现,哮喘病人气道内并非全部以嗜酸性粒细胞浸润为主,大量的中性粒细胞(Neu)出现在哮喘急性发作期和一些致死性哮喘发作的病人气道内。目前认为中性粒细胞浸润气道是重症哮喘气道炎症的重要表型之一,而且与糖皮质激素治疗反应性差相关。虽然只占哮喘病例的5%至10%不等,但重症哮喘病人对现有的治疗药物如吸入性糖皮质激素联合长效β2肾上腺素能受体激动剂(ICS+LABA)、白三烯受体拮抗剂(LTRA)、茶碱、长效胆碱能受体拮抗剂(LAMA)等反应差,因此构成了哮喘防治的巨大医疗支出负担。研究中性粒细胞性哮喘表型及其病理生理机制对于哮喘的预防和治疗,尤其是对于重症哮喘、激素抵抗性哮喘的防治有着非常重要的意义。过去认为过敏性哮喘发病的免疫学机制为“Th1/Th2失衡”,气道内Th2反应增强,Th2细胞因子IL-4、IL-5和IL-13等增高,形成嗜酸性粒细胞气道炎症。在此理论基础上,研究者研发了针对Th2因子的靶向治疗药物,如抗IL-5和IL-13的单克隆抗体及人重组IL-4受体等,试图逆转Th1/Th2失衡,但一些临床试验结果并不令人满意。另一方面,使用Th1细胞因子治疗哮喘也基本无效。因此,“Th1/Th2失衡”学说不能完全阐明嗜酸性粒细胞性哮喘的发病机制,更不能解释中性粒细胞性哮喘的病理生理改变,后者可能存在不同免疫学机制。在随后的临床研究中观察到,IL-17、IL-1β、IL-6、IL-8等炎症因子在中性粒细胞性哮喘病人的诱导痰上清、支气管肺泡灌洗液(BALF)及支气管肺组织标本中表达增高,且IL-17可能与中性粒细胞性哮喘病人气道高反应性(AHR)正相关,但确切的机制仍不明。CD4+辅助性T淋巴细胞(Th)是几乎参与机体所有免疫反应的重要免疫细胞之一。IL-17及其分泌细胞CD4+Th17细胞参与了机体对病原菌如细菌、真菌、支原体、衣原体等的清除,并可引起中性粒细胞和/或单核细胞向炎症部位聚集。因此我们推测,在中性粒细胞性哮喘中,CD4+Th17细胞及其分泌的IL-17是引起气道中性粒细胞性炎症的重要机制,对此机制的深入研究可能给临床上重症哮喘的防治提供新的思路。目的本课题拟使用卵清蛋白(ovalbumin,OVA)联合脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)对C57BL/6J小鼠进行致敏以建立哮喘中性粒细胞性炎症模型,并与单纯OVA致敏的嗜酸性粒细胞性炎症模型相比较:气道炎症特点、AHR、BALF中炎症因子表达及脾脏、淋巴结CD4+Th细胞分化情况。最后利用IL-17基因敲除小鼠探讨Th17/IL-17在哮喘中性粒细胞性炎症形成中的作用及机制。方法1.C57BL/6J小鼠30只随机分为3组:对照组(NS组),嗜酸性粒细胞性哮喘组(OVA组)和中性粒细胞性哮喘组(OVA+LPS组),每组10只。于实验第1天、7天致敏小鼠,麻醉小鼠后腹腔注射OVA(50μg)与等容积氢氧化铝混合液100μl,经鼻腔缓缓滴入0.2%OVA 50μl(OVA组)或加LPS 1μg(OVA+LPS组);NS组小鼠给予等体积的生理盐水致敏。实验第14天开始,用1%OVA液进行雾化激发小鼠(OVA组和OVA+LPS组),每次1小时,每天1次,连续5天,对照组用生理盐水代替OVA激发。2.完成激发后的小鼠行气道高反应性(AHR)测定及支气管肺泡灌洗(BAL),对BALF细胞进行计数并分类,BALF上清用ELISA方法检测IL-1β、IL-4、IL-5、IL-8、IL-17表达。3.摘取小鼠完整左肺行病理学检查,观察支气管及肺组织炎症(H&E染色)和气道上皮细胞杯状化生程度(PAS染色)。4.无菌取脾及肺引流淋巴结(LN)制备单细胞悬液,用流式细胞技术分别检测其CD4+Th细胞分化情况。5.参照OVA+LPS组小鼠建模方法用IL-17基因敲除小鼠复制中性粒细胞性哮喘模型,检测气道中炎症细胞总数及分类、炎症因子表达水平,测定气道高反应性(AHR),并观察肺组织病理炎症损害及气道粘液分泌状态。6.流式细胞技术检测IL-17基因敲除小鼠脾脏及肺引流巴结CD4+Th细胞分化情况。结果1.由OVA联合LPS致敏建立的中性粒细胞性哮喘小鼠BALF中炎症细胞以中性粒细胞为主,与单纯OVA致敏建立的嗜酸性粒细胞性哮喘小鼠相比较,具有更高的气道反应性和更严重的肺组织炎症,但其气道上皮细胞杯状化生降低;2.中性粒细胞性哮喘小鼠BALF中IL-1β(P<0.05)、IL-8(P<0.001)和IL-17(P<0.05)因子水平显著高于嗜酸性粒细胞性哮喘小鼠,而Th2细胞因子IL-4(P<0.01)和IL-5(P<0.001)水平显著低于嗜酸性粒细胞性哮喘小鼠;3.中性粒细胞性哮喘小鼠脾脏及肺引流淋巴结(LN)中CD4+Th细胞分化与嗜酸性粒细胞性哮喘小鼠相比较,CD4+IL-17+Th17细胞分化增多(脾:P<0.05;LN:P<0.05),CD4+IL-4+Th2细胞分化减少(脾:P<0.001;LN:P<0.001),而CD4+IFNγ+Th1细胞分化无明显变化(脾:P>0.05;LN:P>0.05);4.与野生型中性粒细胞性哮喘小鼠相比较,IL-17基因敲除小鼠气道反应性降低、BALF中细胞总数(P<0.01)及中性粒细胞(P<0.001)明显减少,肺组织炎症减轻,但BALF中嗜酸性粒细胞数(P<0.01)增多,气道上皮杯状化生增加;5.IL-17基因敲除小鼠BALF中Th2细胞因子IL-4(P<0.05)和IL-5(P<0.05)表达高于野生型中性粒细胞性哮喘小鼠,IL-1β(P<0.05)、IL-8(P<0.001)和IL-17(P<0.001)明显低于野生型中性粒细胞性哮喘小鼠;6.与野生型中性粒细胞性哮喘组小鼠相比较,IL-17基因敲除鼠脾脏及肺引流淋巴结中CD4+IL-17+Th17细胞分化明显降低(P<0.001),CD4+IL-4+Th2细胞分化升高(脾:P<0.01;LN:P<0.001);脾CD4+IFNγ+Th1细胞分化减少(P<0.05),而淋巴结CD4+IFNγ+Th1细胞分化无变化(P>0.05)。结论及意义1.用OVA联合LPS复制的中性粒细胞性哮喘小鼠模型,表现为典型的中性粒细胞性炎症,与仅用OVA致敏的嗜酸性粒细胞性哮喘小鼠相比较,有更高的气道反应性和更重的肺组织炎症损害。2.CD4+IL-17+Th17细胞分化增加及其分泌的IL-17是引起哮喘中性粒细胞性炎症表型的重要机制;3.CD4+IL-17+Th17细胞的增高及IL-17的高表达抑制了CD4+IL-4+Th2细胞分化,并进一步抑制了哮喘的Th2反应,即抑制了气道内嗜酸性粒细胞浸润、粘液高分泌及Th2细胞因子过表达。本文结果的意义在于,在动物模型中证实了,反复细菌感染接触内毒素可以使哮喘气道炎症表型从嗜酸性粒细胞性炎症转变为中性粒细胞性炎症,其机制依赖于CD4+Th17细胞的分化及其分泌的IL-17。此机制的发现为“卫生假说”补充了免疫学机制的证据。Th17细胞途径是哮喘中性粒细胞性炎症发生发展的关键环节,是治疗中性粒细胞性哮喘的潜在靶点。