论文部分内容阅读
斑节对虾(Penaeus monodon)具有味道鲜美、营养丰富、成长快等特点,目前为东南亚海域及中国南海海域重要养殖经济水产种类。但近年来由于海洋环境污染日趋严重,水体微生物等物质经常严重超标,致使斑节对虾的养殖产业发展因此受到严重影响。其中哈维弧菌是一种广泛存在于海洋环境中可以感染甲壳类、鱼类、贝类的条件致病菌,易引发突眼、慢性皮肤溃疡、败血症等动物病症,而细胞自噬可吞噬细菌或者病毒,对细胞免疫有重要的意义。在细菌与宿主互作中基因表达调控起非常重要的作用,miRNA是调控基因表达的重要因子,故研究miRNA调控细胞自噬基因在哈维弧菌刺激下的作用就很有意义。本实验利用已构建的斑节对虾转录组数据库筛选出ATG5和ATG12 EST序列,用primer软件设计特异性引物,PCR进行ORF验证,利用RACE技术扩增得到ATG5和ATG12基因的3’末端,以此得到两个基因的全长。确定了斑节对虾ATG5和ATG12基因在不同组织中的表达分布规律;对靶向调控ATG5和ATG12的miRNA进行了筛选,并利用双荧光素报告实验进行了验证;利用荧光定量PCR的方法及western blot免疫印迹等方法对ATG5、ATG12与miR-7562在哈维弧菌应激下的表达调控关系进行了研究,并初步对由哈维弧菌应激所产生的细胞自噬、miR-7562及ATG5-ATG12共轭系统之间关联情况进行了鉴定,具体研究结果如下:(1)PmATG5基因序列cDNA主要为5’-UTR包含114 bp、1357 bp 3’-UTR和一个编码269个氨基酸的810 bp开放阅读框。PmATG5分子量为31.125 kDa,其理论等电点为5.66。PmATG12基因序列cDNA全长1101bp,包含363 bp的ORF,16 bp的5’-UTR和722 bp的3’-UTR。开放阅读框编码120个氨基酸,分子量为13.59 kDa,理论等电点为6.12。PmATG5和PmATG12在斑节对虾各个组织中均有表达,在肌肉组织中表达量最高,且两者的表达模式有一定的相似性。序列比对结果显示,PmATG5氨基酸序列与蓝蟹的ATG5一致性高达87%,PmATG12的序列则与家蚕有较高的一致性。表明两者在进化上都高度保守,ATG5和ATG12对机体有十分重要的作用。(2)miRNA的筛选:靶基因预测使用的为mireap,miranda,targetscan三个软件,miRNA靶基因预测的结果是取三个软件的交集。从本实验室已有的小RNA文库筛选调控ATG5和ATG12的miRNA,共有22种miRNA调控ATG5,有24种miRNA调控ATG12,共同调控PmATG5和PmATG12基因的有三种,分别是mir-7562,mir-8485,mir-278。当斑节对虾受到哈维弧菌刺激时,miR-278和miR-7562在6h和24h均有明显的下调,PmATG5的相对表达量在72h达到最高,约为对照组的3.8倍,而PmATG12的相对表达量在哈维弧菌应激72h时达到最高,约为对照组的1.6倍,miRNA的表达与PmATG5和PmATG12表达呈负相关。双荧光素报告结果显示:miR-7562可以调控带有ATG5 3’UTR的荧光素的表达(p<0.0001);而在结合位点突变后,这种调控关系减弱(p=0.0022),减弱9.3%。由此证实miR-7562可能通过该结合位点调控荧光素的表达。miR-7562可以调控带有ATG12 3’UTR的荧光素的表达(p<0.0001);而在结合位点突变后,这种调控关系明显减弱(p=0.0246),减弱46.2%。miR-7562可以调控带有ATG5 3’UTR的荧光素的表达和ATG12 3’UTR的荧光素的表达。(3)miRNA通过调节ATG5、ATG12的转录水平介导细胞自噬。过量表达miR-7562可使PmATG5在24h和48h的相对表达量下调,约为对照组的0.67倍和0.81倍,可使PmATG12相对表达量明显下调,在24h时约为对照组的0.62倍;沉默miR-7562可使PmATG5和PmATG12相对表达量上调,分别在24h显著高于对照组2.2倍和1.43倍。免疫印迹结果显示:过量表达miR-7562后,在48h斑节对虾细胞自噬水平下降;沉默miR-7562后,在48h斑节对虾细胞自噬水平明显升高。(4)哈维弧菌刺激下,miR-7562调节的PmATG5和PmATG12在细胞自噬中的作用。荧光定量PCR结果显示斑节对虾受到哈维弧菌刺激后,过表达miR-7562(miR-7562-agomir)的斑节对虾的PmATG5的相对表达量在24h与(V.harveyi+NCM)对照组相比明显下调,而PmATG12相对表达量在注射6h和24h时与(V.harveyi+NCM)组相比表现下调,蛋白定量结果表明,斑节对虾的细胞自噬较对照组相比在48h和72h明显下调;沉默miR-7562(miR-7562-antagomir)的斑节对虾的PmATG5在24h相对表达量与(V.harveyi+NCI)对照组比明显上调,而PmATG12在注射6h和24h时与(V.harveyi+NCM)对照组相比相对表达量表现上调,蛋白定量结果表明,斑节对虾在48h、72h细胞自噬程度较对照组明显上调。在哈维弧菌刺激下,无论是干扰ATG5/ATG12单个基因的表达,还是同时干扰ATG5和ATG12的表达,细胞自噬水平较对照组都明显下调。种种结果都表明,miR-7562调控的细胞自噬相关基因ATG5和ATG12在哈维弧菌刺激斑节对虾下调控其细胞自噬。