论文部分内容阅读
胚胎附植及妊娠建立,无论对人类生殖健康,还是家畜繁殖都有具有重要意义。附植和妊娠过程一直是生殖生理学研究的重点和难点,这个过程涉及到母体与胎儿之间的相互协同作用,需要营养代谢、免疫容受、内分泌、血液循环、子宫内膜重塑、细胞粘附等诸多环节的动态、精确的同步调控。在胚胎附植期间,孕体与母体子宫内膜之间需要建立一种相互协调的对话关系,即母胎对话,异常母胎对话往往导致妊娠失败。目前,虽然已经报道了许多激素和细胞因子参与母胎对话过程,然而对于这一过程中整体的基因表达特征还不清楚。此外,miRNA作为重要的基因表达重要的调控方式,在母胎对话中的作用尚无系统报道。本研究采用包括转录组（transcriptome）、蛋白质组（Proteome）、小RNA测序（Small RNA-seq）等高通量的分析手段,为深入系统地解析其复杂的生物学过程提供参考。本研究以小尾寒羊为研究对象,在其妊娠第17天,对附植窗口期的孕体和子宫内膜取样,并通过数字表达谱（Digital Gene Expression, DGE）测序分析得到小RNA、以及转录组,并且运用高效液相色谱和串联质谱（LC-MS/MS）联用获得蛋白组数据,然后结合生物信息学分析,进行如下研究：（1）通过分析小RNA数据预测羊孕体和子宫内膜中新miRNA （Novel miRNA）并对其编辑率进行分析。利用MiRDeep2软件,在测序获得的小心A数据库中检测出110个已知miRNA,并预测得到405个潜在新]miRNA （Potential novel miRNA）。去掉有二级结构错误的miRNA之后,获得376个候选新miRNA （Candidate novel miRNA）.然后将孕体、子宫阜和子宫阜间区的总miRNA编辑率比较,子宫内膜：miRNA的编辑率在第9位明显高于孕体,而在第12位恰好相反。另外,本研究对所有具体miRNA编辑率分析,发现其在不同组织中编辑率也存在明显差异。部分miRNA在第2、5和16位编辑率差异明显,表明miRNA的编辑率在不同的组织间呈现多样化特征。（2）将孕体和子宫内膜包括子宫阜区（Canrucular areas, C area）和子宫阜间区（Inter-caruncular areas, IC areas）的基因表达进行聚类分析,分成不同表达模式基因簇（Cluster）,并分别对各组之间进行两两比较,然后将不同表达模式基因以及两两比较的差异表达基因用Gene Ontology, Revigo, String和KEGG pathway等软件进行基因功能富集分析。发现在孕体中高表达的基因主要富集在能量代谢,粘附和细胞周期等条目。而在C区中高表达的基因富集在粘附、免疫等条目。IC区的大部分基因富集在细胞因子分泌、粘附、细胞形态发育等条目。深入分析转录组结果发现很多粘附和胞外基质分子都在孕体和子宫内膜高表达,暗示在附植窗口期这些分子起到重要作用。（3）通过miRNA数据与转录组数据的整合分析,进一步分析miRNA在母胎对话中的作用。利用TargetScan、miranda和RNAhybrid三种靶基因预测软件对差异miRNA的靶基因预测。然后将差异miRNA的靶基因和差异表达基因取交集,并将筛选出的miRNA靶基因进行功能富集,发现一批候选miRNA可能作为调控因子参与母胎对话的功能调控。例如OAR-MIR-432在子宫内膜中低表达,上调其靶基因Fermt3、Pard6a、Stat2和Tspan31分别可能参与细胞粘附,迁移,分化增殖；细胞分裂与极化；IFNT-tau识别的信号转导和跨膜转运等功能。进一步,本研究将差异miRNA的靶基因和差异蛋白整合分析,发现某些miRNA直接对基因翻译有抑制作用,而不影响mRNA。例如OARl 12343在孕体中上调,其靶基因是Co17al,其mRNA丰度不变化,而蛋白丰度下调,说明OAR112343可能直接抑制翻译过程而不对mRNA产生影响。（4）本研究用羊为研究对象比较了孕体和子宫内膜（子宫阜区和子宫阜间区）中IVP和IVO组中转录组表达谱。我们鉴定了附植第17天的差异表达基因。通过GO和KEGG富集分析我们发现孕体的差异基因主要富集在细胞粘附,细胞周期；子宫阜区,差异基因主要富集在细胞凋亡,细胞粘附；子宫阜间区中,差异基因主要富集在信号转导和转运。这些差异基因是进一步研究IVP诱导的胚胎附植失败的潜在关键基因。另外,本研究通过比较体内、外两种条件下产生的胚胎,其成功或失败妊娠基因表达谱的差异,筛选出妊娠成功的特征基因。本研究将体内外两种条件下成功和失败妊娠的表达谱进行比较,获得共有的差异基因。结合已经发表文献对相关基因功能报道,筛选成功妊娠的候选特征基因。发现Pletl、Mx2、Ifit3、Ifitl等基因在成功妊娠中特异高表达,可能为成功妊娠的特征基因。本研究利用多个层次的高通量测序手段,首次在羊孕体和子宫内膜中发现大量新miRNA,并且通过]miRNA组、转录组和蛋白组整合分析发现大量可能参与绵羊母胎对话基因表达调控的miRNA,其中部分miRNA是首次在绵羊中报道。另外呈现了附植窗口期母胎对话的转录组情况,并发现很多粘附和胞外基质分子在此阶段有重要作用。通过体内、外两种条件下成功与失败附植比较,筛选出成功附植的关键候选基因。这些信息将为今后研究绵羊miRNA和母胎对话调控机制提供有效的参考。