立枯丝核菌菌核形成过程中H2O2的作用及CAT的功能分析

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玉米纹枯病是一种世界性的土传病害,随着国内玉米种植面积的扩大,该病逐渐加重,在玉米生产上带来严重影响。玉米纹枯病的病原真菌是立枯丝核菌,该病原菌以形成菌核结构在土壤和病残体中躲过逆境,适宜条件下再次萌发造成二次侵染,因此对菌核的形成与发育机理研究至关重要。从实验室构建的立枯丝核菌菌核形成的转录组库入手分析,发现过氧化氢酶基因(CAT)在菌核形成过程中出现明显的表达差异,于是从转录库中筛选并克隆了CAT基因序列,对该基因编码的氨基酸序列进行生物信息学分析,深入研究H2O2与CAT互作产生的氧胁迫在菌核形成过程中的作用,主要结果如下:1.设计特异性引物克隆CAT基因的全长并对其氨基酸序列进行生物信息学分析,结果表明:该基因全长2014bp,序列本身就是一条完整的开放阅读框,该蛋白由679个氨基酸组成,推测分子量为76.869KD,理论等电点为8.56,结构域分析该蛋白是一种典型的单功能血红素过氧化氢酶,既不存在跨膜结构也无信号肽,具有亲水性,亚细胞定位主要功能场所在线粒体上,系统进化分析表明,立枯丝核菌CAT蛋白与Laccaria bicolor(双色蜡蘑)的CAT亲缘性最近。2.通过外源添加H2O2和过氧化氢酶抑制剂(3-amino-1,2,4-triazo Ie,AT)造成菌内不同程度的H2O2胁迫,研究该胁迫对立枯丝核菌菌核形成的影响,结果显示:外源浓度为10-6 mol/L H2O2最能够显著促进菌丝的生长和菌核的发育,外源浓度为0.5 mmol/L AT最能够显著促进菌核的分化,同时抑制了菌丝的生长速度和菌核的发育,这表明菌内不同浓度的H2O2造成的氧胁迫对菌丝的生长和菌核的分化会造成不同的影响。3.检测10-6 mol/L H2O2处理组和0.5 mmol/L AT处理组H2O2浓度和CAT活性,结果表明:细胞内H2O2浓度为49μmol/g时,促进了立枯丝核菌菌丝生长;细胞内H2O2浓度为80μmol/g时。促进了立枯丝核菌菌核的分化;CAT活性检测结果表明,立枯丝核菌菌核形成过程中CAT活性与H2O2浓度呈正相关,并且0.5 mmol/L AT会使CAT的活性降低大约50%。4.通过实时荧光定量PCR研究立枯丝核菌CAT基因在菌核形成过程中,H2O2处理和AT处理的表达情况,结果表明:菌丝生长阶段CAT表达量很低,在菌核分化初期时开始上升,在菌核基本成熟时到最高值,然后开始下降,且在一定浓度范围内菌内H2O2浓度越高,CAT基因的表达量越高,并且抑制剂的使用不会抑制CAT基因的表达。表明CAT基因在菌核形成过程中通过菌内H2O2浓度调节自身转录水平,保证菌丝的生长和菌核的正常发育。
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