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第一部分NGDN基因mRNA表达水平与急性髓细胞白血病患者临床特征关系的研究目的探讨Neuroguidin（NGDN）基因mRNA表达水平与急性髓细胞白血病（Acute myeloid leukemia, AML）患者临床特征之间的关系。方法荧光定量RT-PCR检测59例初发AML患者NGDN基因mRNA表达水平，另检测15例正常人骨髓单个核细胞NGDN基因mRNA表达水平作为对照，对59例患者NGDN基因进行全长cDNA测序，收集临床资料，分析NGDN基因mRNA表达水平及cDNA突变情况与临床特征的关系。结果15例正常人骨髓单个核细胞NGDN基因mRNA相对于内参的平均表达水平为1.7，据此将59例病人分为NGDN低表达组（NGDNmRNA<1.7）和NGDN高表达组（NGDNmRNA>1.7），统计分析显示这两组患者在年龄、性别、发热、贫血、出血、髓外侵犯、WBC计数、PLT计数、FAB分型、分子学预后及免疫学表型等方面均无统计学差异（P>0.05）。NGDN高表达组的34例病人中20例（58.82%）骨髓原始细胞<70%，NGDN低表达组的25例病人中只有7例（28%）<70%，两组差异具有统计学显著性意义(P=0.019)。NGDN高表达组中16例（47.05%）外周血原始细胞<30%，而NGDN低表达组中只有6例（24%）<30%，但两组差异不具有统计学显著性意义(P=0.070)。NGDN高表达组诱导化疗达完全缓解（complete remession, CR）只需1疗程的患者为23例（67%），NGDN低表达组为11例（44%），但两组间差异尚不具有统计学显著性意义（P=0.069），可能与检测病例数有限有关。对59例病人NGDN基因cDNA测序，共检测到7g>A、7g>R、9a>G、297g>A、297g>R、1560g>A、1560g>R、306c>A、306c>M、380t>Y、1306a>R和1183c>s12种无义突变，每位患者可有2种以上突变。另有一位患者检测到247a>M有义突变，即247A突变成C，相应83位氨基酸由赖氨酸突变成谷氨酰胺。结论初发AML患者NGDN基因mRNA水平越高，其骨髓原始细胞比例越低，达到CR的诱导疗程数可能越少；AML患者NGDN基因虽然突变点及突变种类众多，但很少存在有义突变，其临床意义还有待进一步研究。第二部分NGDN基因与人髓系白血病细胞化疗敏感性关系的体外研究目的探讨NGDN基因和人髓系白血病细胞化疗敏感性的关系。方法通过携带NGDN基因的慢病毒载体转染人髓系白血病细胞系K562及K562衍生的表达P-糖蛋白（glycoprotein，P-gp）的多药耐药细胞亚系K562/A02，荧光显微镜、流式细胞仪及RT-PCR技术验证转染效率及NGDN基因mRNA表达水平。CCK-8法测定K562、K562-CON (转染空载体)、K562-NGDN（转染NGDN基因）、K562/A02及K562/A02-NGDN细胞在常用化疗药物VCR、VP-16、ADM和DNR作用下的增殖抑制率，比较各组间的差异；流式细胞仪测定K562、K562-Con、K562-NGDN、K562/A02及K562/A02-NGDN细胞在4种化疗药物作用下的凋亡率，比较各组间的差异。结果成功构建携带NGDN基因的K562-NGDN及多药耐药K562/A02-NGDN细胞，绿色荧光蛋白表达量大于90%，K562-NGDN细胞NGDN mRNA的表达水平是K562细胞的8.2倍，K562/A02-NGDN细胞NGDN mRNA的表达水平是K562/A02细胞的11.3倍。各组细胞自然状态下一周内的生长曲线无显著差异。不同浓度化疗药物VCR、ADM、DNR、VP-16作用不同时间后对K562-NGDN细胞的增殖抑制率较K562、K562-CON细胞显著增加（P<0.05）。如VCR0.5μM作用36h后K562、K562-CON和K562-NGDN细胞的增殖抑制率分别是57.50±2.1%、55.73±1.60%和72.26±3.83%(K562-NGDN vs K562，P<0.05；K562-NGDN vsK562-CON，P<0.05)；VP-1620μM作用36h后K562、K562-CON和K562-NGDN细胞的增殖抑制率分别是43.06±2.67%、46.50±2.89%和65.10±3.65%(K562-NGDN vsK562，P<0.05；K562-NGDN vs，P<0.05)；DNR8μM作用36h后K562、K562-CON和K562-NGDN细胞K562-CON的增殖抑制率分别是63.43±3.0%、65.20±1.49%和76.53±3.05%(K562-NGDN vs K562， P<0.05；K562-NGDN vsK562-Con，P<0.05)；ADM8μM作用36h后K562、K562-CON和K562-NGDN细胞的增殖抑制率分别是65.23±3.02%、63.4±3.0%和76.53±2.13%(K562-NGDN vs K562，P<0.05；K562-NGDN vsK562-CON，P<0.05)。另外不同浓度化疗药物VCR、ADM、VP-16作用不同时间后对K562/A02-NGDN细胞的增殖抑制率亦较k562/A02细胞显著增加（p<0.05)。如VCR2μM作用36h后K562/A02、K562/A02-NGDN细胞的增殖抑制率分别是24.75±2.08%和36.27±2.45%(P<0.05)；VP-1690μM作用36h后K562/A02、K562/A02-NGDN细胞的增殖抑制率分别是63.77±3.42%和76.66±2.25%(P<0.05)；ADM50μM作用36h后K562/A02，K562/A02-NGDN细胞的增殖抑制率分别是45.73±1.93%和59.15±2.75%(P<0.05)。不同浓度化疗药物VCR、ADM、DNR、VP-16作用不同时间后K562-NGDN细胞较K562、K562-CON细胞凋亡率显著增加(P<0.05)。如VCR0.5μM作用36h后K562、K562-CON和K562-NGDN细胞的凋亡率分别是34.17±2.37%、37.69±3.32%和52.75±5.51%(K562-NGDN vs K562，P<0.05；K562-NGDN vsK562-CON，P <0.05)（图2.14，图2.19）；VP-1620μM作用36h后K562、K562-CON和K562-NGDN凋亡率分别是21.58±1.45%、22.35±1.07%和33.09±1.16%(K562-NGDN vs K562，P<0.05；K562-NGDN vs K562-CON，P<0.05)（图2.15，图2.20）；DNR4μM作用48h后K562、K562-CON和K562-NGDN凋亡率分别是40.03±3.52%、41.53±3.25%和55.84±2.61%(K562-NGDN vs K562，P<0.05；K562-NGDN vs K562-CON，P<0.05)（图2.16，图2.21）；ADM8μM作用36h后K562、K562-CON和K562-NGDN凋亡率分别是30.07±3.05%、28.92±2.51%和41.35±2.27%(K562-NGDNvsK562，P<0.05；K562-NGDNvs K562-CON，P<0.05)（图2.17，图2.22）。另外不同浓度化疗药物VCR、DNR、VP-16作用不同时间后K562/A02-NGDN细胞较K562/A02细胞凋亡率亦显著增加(P<0.05)。如VCR10μM作用24h后K562/A02和K562/A02-NGDN凋亡率分别为18.45±1.34%和32.8±4.73%(P<0.05),VP-16180μM作用24h后K562/A02和K562/A02-NGDN凋亡率分别为19.3±1.69%和26.7±0.84%(P<0.05)；ADM200μM作用24h后K562/A02和K562/A02-NGDN凋亡率分别为23.85±1.06%和41.9±3.25%(P<0.05)。结论NGDN基因过表达可增加人髓系白血病细胞对常用化疗药物VCR、VP-16、ADM和DNR的敏感性；NGDN基因对白血病细胞的化疗增敏作用不受P-gp表达的影响。第三部分NGDN基因在人白血病细胞中的作用通路研究目的探讨NGDN基因在人白血病细胞中可能的作用通路方法利用携带shRNA-NGDN的慢病毒转染多药耐药细胞系K562/A02构建NGDN基因敲除模型（K562/A02-KD），同时以携带无关基因的慢病毒转染K562/A02细胞获得阴性对照细胞（K562/A02-NC），通过定量RT-PCR芯片方法检测比较K562/A02-KD和K562/A02-NC细胞内mTOR通路及相关基因mRNA的表达水平。结果K562/A02-NC细胞的NGDN基因mRNA表达水平约是K562/A02-KD细胞的4.7倍（p=0.009）。定量RT-PCR芯片结果两组细胞有69个基因mRNA表达水平有统计学差异（P<0.05），另根据差异基因筛选标准（差异值Log2(KD/NC)>0.585为上调，差异值<-0.584为下调，P <0.05），共有40个基因mRNA表达水平有显著差异。其中K562/A02-KD细胞较K562/A02-NC细胞显著高表达的基因包括胞外信号基因、信号传导基因、转录因子基因、细胞侵袭和转移相关基因、细胞骨架基因及癌基因，其中胞外信号基因包括TNF、IGF1等，信号传导通路基因涉及MAPK、NF-κB、JAK-STAT、Toll样及mTOR通路，转录因子基因包括NFAT、HSF1、E2F1、ELK1，细胞侵袭和转移相关基因包括CTNN、FN1、VIM、ITGAM，癌基因包括MYC、ras、FOS等。另外，K562/A02-KD细胞有少数基因mRNA表达水平较K562/A02-NC细胞下降，包括TP53、PDGFB、PECAM1、CD44、CYP19A1及ACTA2等。特别有意义的是PI3K-Akt-mTOR通路核心蛋白PI3K、PDK1、Akt、mTOR基因在K562/A02-KD细胞中表达显著上调，mTOR通路下游4E-BP1、S6K基因表达亦有上调，而S6K下游分子rpS6基因在K562/A02-KD细胞中表达下调。结论抑制NGDN基因的表达使得常见肿瘤相关信号通路活化、转录因子及癌基因表达升高，可能促进肿瘤增殖、侵袭及抑制肿瘤凋亡等。另外抑制NGDN基因导致PI3K-Akt-mTOR-4EBP1/S6K通路基因表达增高和下游rpS6表达下调，推断NGDN位于PI3K-Akt-mTOR下游和rpS6的上游，可能与4E-BP1/S6K作用类似，可负反馈调节PI3K-Akt-mTOR通路。