【摘 要】
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目的1.研究PLEK2在胆囊癌组织中的表达及其与临床预后的关系。2.研究PLEK2对胆囊癌细胞迁移、侵袭的影响,并在体内进一步证实PLEK2对胆囊癌转移的增强作用,为临床寻找靶向治疗药物提供实验基础。3.探讨PLEK2促进胆囊癌细胞迁移、侵袭的分子机制。方法1.从医院收集6对转移的胆囊癌和癌旁组织制成m RNA表达谱芯片,从表达升高最明显的20个基因中,我们筛选出PLEK2基因。扩大样本到10对转
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目的1.研究PLEK2在胆囊癌组织中的表达及其与临床预后的关系。2.研究PLEK2对胆囊癌细胞迁移、侵袭的影响,并在体内进一步证实PLEK2对胆囊癌转移的增强作用,为临床寻找靶向治疗药物提供实验基础。3.探讨PLEK2促进胆囊癌细胞迁移、侵袭的分子机制。方法1.从医院收集6对转移的胆囊癌和癌旁组织制成m RNA表达谱芯片,从表达升高最明显的20个基因中,我们筛选出PLEK2基因。扩大样本到10对转移的胆囊癌和癌旁组织样本,实时荧光定量PCR证实PLEK2的表达。随后,我们用139例胆囊癌和150例胆囊结石病人的石蜡切片制成的组织芯片,免疫组织化学染色分析PLEK2在胆囊癌和胆囊结石中的表达差异。2.在细胞实验中,我们首先构建了PLEK2下调和过表达的胆囊癌细胞株。用transwell实验证实PLEK2下调和过表达对细胞迁移和侵袭的影响。另外我们把PLEK2下调和对照组细胞分别接种到6只裸鼠皮下,6周后处死裸鼠,观察裸鼠肝脏肿瘤转移灶,切取肝脏组织HE染色和病理检查。3.在机制研究方面,我们用western blot实验研究了PLEK2下调和过表达对EMT标志物及AKT/mTOR信号通路的影响。为了找到PLEK2影响AKT/mTOR信号通路的机制,我们纯化出PLEK2蛋白,通过蛋白质谱分析找到PLEK2的作用蛋白,再用蛋白免疫共沉淀证实。最后过表达SHIP2和使用PI3K抑制剂LY294002观察是否逆转PLEK2的生物学功能。结果1.PLEK2在15对胆囊癌中明显高表达。后续的组织芯片中,PLEK2在胆囊癌中相对结石组织也明显高表达,且与肿瘤的大小、TNM分期和远端转移相关,PLEK2高表达的患者预后要差于PLEK2低表达的患者（HR:1.86（1.27-2.74）,P=0.002,单因素;1.94（1.30-2.91）,P=0.001,多因素）。2.PLEK2下调能明显抑制胆囊癌细胞的迁移和侵袭,反之促进迁移和侵袭。PLEK2下调组裸鼠肝脏转移灶数目远少于对照组,且HE染色证实肝脏转移灶确为胆囊癌细胞来源。3.PLEK2促进胆囊癌细胞迁移和侵袭是通过调控EMT实现的。另外PLEK2下调能明显抑制AKT的473位磷酸化,并且下游的mTOR磷酸化也受到抑制。从质谱结果中我们找出SHIP2蛋白,后续实验证实PLEK2与SHIP2能相互结合。PLEK2通过调控SHIP2抑制了EGFR的降解,从而促进AKT/mTOR信号通路的活化。SHIP2过表达能逆转PLEK2下调对胆囊癌细胞迁移侵袭的抑制作用,另外LY294002能抑制PLEK2过表达对细胞迁移侵袭的促进作用。结论1.PLEK2在胆囊癌组织中异常高表达,并与胆囊癌预后负相关。2.PLEK2促进上皮间充质转化从而增强胆囊癌细胞迁移、侵袭和肿瘤转移。3.PLEK2通过SHIP2抑制EGFR降解进而促进AKT/mTOR信号通路的活化。
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