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木质素(Lignin)是苯丙烷代谢途径(Phenylpropane metabolic pathway)的关键代谢产物,能增强机体强度,促进水分和营养物质输送并能抵抗不良外部环境等重要生理作用,它在植物从水生植物到陆生植物的进化中起着至关重要的作用。小立碗藓(Physcomitrella patens)是早期登陆的植物代表,含有除F5H外的整套木质素合成基因,但是目前仍不能明确苔藓植物是否能够合成木质素。肉桂醇脱氢酶(Cinnamy1-alcoho1 dehydrogenase,CAD)是木质素合成途径的最终反应酶,羟基肉桂醛是它在的作用下被还原为相应的三种肉桂醇。初步实验分析表明类木质素可能在小立碗藓感染灰霉菌后诱导合成。本论文主要研究小立碗藓CAD1基因功能,及探讨在灰霉菌胁迫下的小立碗藓CAD1的3种株系(WT、CAD1-KO及CAD1-OE)中木质素合成途径中关键基因的转录水平。鉴于小立碗藓是理想的研究基因功能的材料及其特殊的进化地位,本课题的研究结果本课题的研究结果初探PpCAD1的基因功能,为了解小立碗藓PpCAD1转录水平对整个木质素途径的影响奠定良好基础。1、分别构建CAD1超表达载体和基因敲除载体,通过聚乙二醇介导的原生质体转化将超表达载体和基因敲除载体分别转化到小立碗藓原生质体中。分子鉴定结果表明已成功获得了含敲除载体(CAD1-KO)和超表达载体(CAD1-OE)的转化株。qRT-PCR显示在小立碗藓CAD1-KO中CAD1表达水平仅为正常表达水平的0.0018倍,而CAD1-OE中CAD1的表达量可达正常表达量的15.27倍。2、初步研究了小立碗藓WT、CAD1-KO和CAD1-OE在灰霉菌接种前后的CAD酶活性变化,研究显示:CAD1-OE中CAD酶活性均高于WT(1.92 nmol/min/g FW)与CAD1-KO(1.48 nmol/min/g FW),为2.81 nmol/min/g FW,表明CAD1表达水平可能影响CAD酶活性;接种2 d时,WT的CAD酶活较接种前升高1.78倍,CAD1-KO的CAD酶活较接种前升高约1.52倍,CAD1-OE的CAD酶活较接种前升高约1.27倍,表明感染灰霉菌会导致WT、CAD1-KO和CAD1-OE的CAD酶活性增加。3、初步测定了小立碗藓WT、CAD1-KO和CAD1-OE在灰霉菌接种前后的总酚含量,结果得到未感染灰霉菌时,WT、CAD1-KO和CAD1-OE的总酚含量分别为0.513 mg/g、0.332 mg/g和0.835 mg/g,表明CAD1参与酚类物质的积累;接种3 d时WT总酚含量为1.840mg/g,比接种前高出2.61倍,CAD1-KO总酚含量为1.548 mg/g,比接种前高出3.66倍,CAD1-OE总酚含量为3.019 mg/g,比接种前高出2.61倍,说明灰霉菌接种后会诱导WT、CAD1-KO及CAD1-OE植株中发生酚类物质积累。4、运用qRT-PCR分析在病原菌感染时小立碗藓木质素途径关键基因的转录水平表达情况。结果显示:敲除CAD1后,CAD其余3个家族成员不会对其进行代偿性表达;CAD1表达水平变化,会改变C4H1、C4H2、CCoAOMT2、CCR2、CCR3、CCR5、COMT2等木质素合成基因的表达水平,并导致CAD1-OE中大多数木质素合成基因出现与WT植株不同的基因表达模式。表明CAD1表达水平变化也可能调控整个木质素合成途径中部分基因的表达。真菌感染可诱导C4H1、C4H2、CCoAOMT2、CCR2、CCR3、CCR5、COMT1、CAD3、CAD4等小立碗藓木质素生物合成途径关键酶的基因出现差异性表达,也可能导致苯丙烷类代谢途径多基因,多通路的抗病反应。