茶树[Camellia sinensis(L.)O.Kuntze]是一种重要的经济作物,茶也是世界三大无酒精饮料之一。锰是茶树生长必需的微量元素之一,但其过量时又会对茶树造成一定的毒害。近年来,化肥的过量施用引起茶园土壤酸化程度急剧增加,对茶树带来潜在的锰毒危害日益增加,而关于茶树锰元素的吸收转运及锰耐受基因功能的相关研究比较匮乏。研究茶树从根系吸收锰元素、在叶片中转运和累积的生理学规律有助于阐明茶树聚集锰元素、耐锰毒的分子机理,为茶树栽培管理提供新思路。本论文以茶树品种’迎霜’和’龙井长叶’为试验材料。通过检测不同浓度锰处理下茶树生理生化指标的变化来研究锰对茶树生长的影响;利用双向凝胶电泳(2-DE)结合基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)技术鉴定茶树响应锰胁迫的差异蛋白;借助模式生物酿酒酵母和拟南芥阐明了CsMTP 参与茶树高锰浓度耐受的分子机理。具体研究内容及结论如下:1、通过检测不同浓度锰处理条件下(0.5、5、100、250和1 000 μM)茶树叶片叶绿素含量、光合作用参数、叶绿荧光参数等分析锰对茶树生长性状的影响;根、茎和叶等不同组织中锰含量的差异、抗氧化系统中超氧化物歧化酶、过氧化物酶、多酚氧化酶的活性以及次生代谢产物咖啡碱、茶多酚和总氨基酸含量的差异,研究锰对茶树生长生理的影响。结果表明,随着锰浓度的升高,茶树的光合作用参数、叶绿荧光参数、叶绿素的含量、超氧化物歧化酶、过氧化物酶的活性呈现先升高后降低的变化趋势;茶多酚、咖啡碱含量依次减少;而多酚氧化酶活性、总氨基酸含量则增加。这表明低浓度锰(0.5和5 μM)对茶树生长具有促进作用,但锰浓度过高(≥250 μM)对茶树生长起到抑制作用;研究结果还表明锰浓度对三种重要次生代谢产物的含量有较大影响。2、对’迎霜’和’龙井长叶’两个品种茶树进行高锰处理,发现’龙井长叶’的耐锰能力比’迎霜’强。使用2-DE结合MALDI-TOFMS技术对耐锰茶树品种’龙井长叶’进行分析,共检测到700多个蛋白点,其中20个差异表达蛋白点(差异值≥1.5)中有11个上调表达,9个下调表达。对其中一个上调蛋白点进行BlastP比对发现,该蛋白点与植物金属耐受有关。利用cDNA末端快速克隆(RACE)结合反转录PCR(RT-PCR)技术获得茶树金属耐受蛋白基因CsMTP8。该基因的ORF全长为1218bp,编码405个氨基酸,相对分子量为44.5 kDa。进化关系分析发现,CsMTP8与拟南芥、水稻和柱花草等相关的金属耐受蛋白有较高的同源性。亚细胞定位结果表明,CsMTP8定位在细胞质膜上。荧光定量PCR(qRT-PCR)发现,在正常锰浓度条件下,CsMTP8在茶树叶中的表达量比根、茎和花中高;而过量的锰(250 μM)显著上调了该基因在茶树叶片中的表达(P<0.05)。3、利用转化CsMTP8到真核模式生物酵母(Saccharomyces cerevisiae)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)分析了该基因的生物学功能。结果发现,CsMTP8通过酵母将细胞内Mn2+外排的方式增强了转基因酵母对高浓度锰的耐受性。此外,高锰胁迫处理下,转基因拟南芥比对照组(空载)具有更好的耐锰性,主要表现为:转基因植株叶片低度黄化、更高的鲜重和根长以及叶片含有更低的锰离子;这些结果表明,CsMTP8在锰的稳态中起着特殊的作用,可能是通过锰离子外排来提高转基因酵母或转基因拟南芥的高浓度锰毒抗性。