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重组激活基因(recombination activating genes,RAGs)是一组具有稳定的能够激活重组反应能力的DNA片段,最早由Schatz等于上个世纪80年代在免疫系统中发现,有RAG1和RAG2两种亚型。它们在淋巴细胞的发育成熟过程中起关键作用,与免疫记忆功能有关,实验证明,敲除动物的RAG1基因可导致免疫记忆功能缺陷。但随着研究的不断深入,人们发现RAG1并非只存在于免疫系统中,在哺乳动物,两栖动物和硬骨鱼类的神经系统中也都存在。Chun等利用PCR、原位杂交和Northern blot分析检测到在鼠的中枢神经系统中有RAG1的低水平转录,转录产物广泛分布于胚胎和生后鼠的神经元内,转录最明显发生于神经细胞分布密集的脑区,小脑和海马结构,这些区域都与学习记忆功能密切相关。因此研究RAG1在与学习记忆有关的脑区表达是否跟学习记忆功能有关,对于开发脑的功能,治疗与学习记忆障碍有关的疾病等方面具有重要的意义。采用RAG1基因敲除技术虽可抑制该基因在免疫记忆中的作用,但同时又有可能引起胚胎期脑发育的异常,从而影响到出生后脑的功能。因此采用基因敲除法来研究RAG1在神经系统的学习记忆功能显然是不合适的。RNA干扰技术是研究目的基因功能的一种新技术,与基因敲除法相比它有许多优点,不仅可使目的基因实时得到抑制,而且不影响动物器官的发育,更有利于研究目的基因的功能,操作也更为简便。早期的RNA干扰技术因受载体影响,在体转染率很低,一般只用于体外实验,而不能用于在体研究。随着对病毒载体的不断深入研究,RNA干扰片段可以由病毒包装后导入体内,转染率也明显增高,使该项技术的应用范围由体外研究转入在体研究。然而目前尚未见到采用RNA干扰方法研究RAG1功能方面的文献报道。为实现本课题组关于RAG1在脑功能方面的作用这一总的研究目标,本课题拟构建携带RAG1干扰片段的慢病毒载体,为实现在体研究脑内RAG1的功能,并阐明RAG1与大脑学习记忆功能的关系奠定基础。【目的】构建RAG1RNAi慢病毒表达载体并转染海马神经元观察其转染效率及对RAG1表达的抑制效应,筛选出高效且特异阻断RAG1基因表达的RNAi重组慢病毒表达载体。【方法】1.RAG1基因RNAi慢病毒载体的构建设计三对针对RAG1基因的shRNA(short hairpin RNA,shRNA)序列,分别命名为shRNA1、shRNA2、shRNA3,用限制性内切酶BamH I+Xho I将pRNAT-U6.2/Lenti载体酶切,将线性化的pRNAT-U6.2/Lenti和shRNA1、shRNA2、shRNA3分别进行连接转化,对其产物酶切后进行DNA测序鉴定;采用慢病毒载体系统将pRsv-Rev,pMDLg/pRRE,pMD2.G三质粒,分别与pRNAT-U6.2/Lenti-shRNA1/RAG1、pRNAT-U6.2/Lenti-shRNA2/RAG1、pRNAT-U6.2/Lenti-shRNA3/RAG1共转染至293T细胞包装成慢病毒载体;用慢病毒感染体外培养的细胞,观察各病毒的感染效率。2.RT-PCR和实时荧光定量PCR收集感染96小时的海马神经元提取总RNA,RT-PCR和实时荧光定量PCR对RAG1mRNA表达水平进行检验。RT-PCR后,电泳分析PCR产物;实时荧光定量PCR后,对RNA产物进行解离曲线分析,排除双峰解离曲线或异常扩增曲线的可能性,然后从各组样品荧光定量PCR动力学曲线中得出其荧光阈值循环数(cycle threshold,Ct)值,与标准曲线进行比较,计算出各组待测样品的RAG1拷贝数来检测RAG1mRNA水平。3.Western blotting收集感染96小时的海马神经元提取蛋白,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,转移到PVDF膜上并加抗体作用,借助ECL法进行观察。【结果】1.利用连接酶将pRNAT-U6.2/Lenti质粒和shRNA1,shRNA2,shRNA3连接转化可获得阳性质粒pRNAT-U6.2/Lenti-shRNA1/RAG1、pRNAT-U6.2/Lenti-shRNA2/RAG1、pRNAT-U6.2/Lenti-shRNA3/RAG1,经鉴定shRNA能准确完整地导入质粒pRNAT-U6.2/Lenti中;采用慢病毒载体系统能获得高滴度的重组慢病毒载体并能有效感染体外培养的细胞使之产生siRNA。″2.分别将各组慢病毒表达载体感染培养的海马神经元后,与未感染组细胞相比较,各感染组对RAG1mRNA和蛋白均有不同程度的抑制作用(P＜0.05),其中shRNA3的抑制作用最强,对RAG1蛋白和mRNA抑制率分别为(67±5.8)%和(77±5.0%),未感染组和感染对照组RAG-1mRNA和蛋白表达水平差异无统计学意义(P＞0.05)。【结论】本研究第一次成功构建并筛选出一个高效且特异阻断RAG1基因表达的RNA干扰慢病毒表达载体,并具有较高滴度,为进一步研究其在体抑制RAG1的表达以及RAG1在中枢神经系统中的功能提供了一个有效工具。